八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細胞體外藥物敏感試驗研究

周影,胡建銘

(蘇州大學附屬第一醫院 婦產科，蘇州 215006)

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八種常用化療藥物組合對人類宮頸癌細胞體外藥物敏感試驗研究

周影,胡建銘

(蘇州大學附屬第一醫院 婦產科，蘇州 215006)

目的 探討臨床宮頸癌原代腫瘤細胞對8種常用化療藥物組合方案的敏感性。方法 2013年6月～2014年10月蘇州大學附屬第一醫院收治的41例宮頸癌術中切下腫瘤組織標本進行體外細胞培養，再將紫杉醇，紫杉醇+順鉑，紫杉醇+卡鉑，托泊替康+順鉑，吉西他濱+順鉑，多西他賽，吉西他濱以及順鉑+環磷酰胺+多柔比星分別設定不同藥物濃度梯度[200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%血漿峰值濃度(plasma peak concertration,PPC)]，采用ATP生物熒光法進行藥敏試驗。結果 8組化療藥物方案血漿峰值濃度下對宮頸癌的敏感性依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環磷酰胺+多柔比星>托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。結論 宮頸癌患者進行化療藥物敏感試驗具有可行性，對臨床個體化化療具有現實指導作用。

宮頸癌；原代腫瘤細胞；化療藥物；敏感性；體外培養

宮頸癌是女性生殖系統3大惡性腫瘤之一，其發病率居婦科惡性腫瘤之首。近年來發病率呈上升和年輕化趨勢。宮頸癌的治療模式為手術及放療，化療僅僅用于不能手術的晚期患者的姑息治療或手術前新輔助化療[1]。隨著醫療技術的不斷發展，臨床治療的不斷深入，醫療工作者發現手術和放療不能控制和消除亞臨床病灶和微小轉移病灶。隨著化療藥物的更新換代、里程碑式的跨越，給藥方法和給藥途徑的不斷改善。選擇針對個體有效的藥物進行化療是治療婦科惡性腫瘤的重要手段之一。本研究通過參考近年來國內外有關文獻[2-3]選擇8種一線及二線宮頸癌化療藥物方案，化療前對個體宮頸癌細胞進行藥物體外敏感試驗，對其細胞毒性進行比較，挑選出有效的單藥或有效(或敏感)聯合藥物組成的化療方案，為臨床個體化化療提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年6月～2014年10月年在蘇州大學附屬第一醫院手術治療的宮頸癌(經病理確診為宮頸原發惡性腫瘤)患者41例標本，年齡24～68歲，平均(43.7±11.2)歲。其中鱗癌32例；腺癌8例；宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例。

1.2 材料 生物熒光抗癌藥物敏感性檢測試劑盒(ATP-chemiluminescence method，簡稱ATP-TCA[11]試劑盒)，由湖州海創生物科技有限公司提供。化療藥物：紫杉醇(taxol，TAX，百時美施貴寶公司，H20130281)，順鉑[4](cisplatin，DDP，江蘇豪森藥業，H20040813)，卡鉑[5](carboplatin，CBP，齊魯制藥，H20020180)，托泊替康[6](topotecan，葛蘭素史克，H20130424)，吉西他濱[7](gemcitabine，GEM，ELI LILLY AND COMPANY，H20110535)，多西他賽[8](docetaxel，江蘇恒瑞醫藥，H20031243)；環磷酰胺(cyclophosphamide，CTX，Toronto Research Chemicals Inc.，H20110407)，多柔比星[9](doxoru，ADM，深圳萬樂藥業，H44024359)。均為一般臨床制劑。其試驗濃度依據藥物的血漿峰值濃度(plasma peak concentration，PPC)確定，以上8種化療藥物的具體血漿峰值濃度見表1。

表1 8種化療藥物的血漿峰值濃度(μg/ mL)

1.3 方法 ATP-TCA操作步驟：取手術切除的新鮮腫瘤組織標本，去除其表面的凝血塊及壞死組織等，剪碎、離心，加入組織消化酶溶液，充分消化后離心，去上清，收集細胞懸液，調整細胞濃度至(1～3)×105/mL，加入96孔細胞培養板中，置37 ℃、5%CO2培養箱中培養4 h后，加入化療藥物，每個藥物設5個濃度(200%，100%，50.0%，25.0%，12.5%PPC)，同時設空白對照孔(不含腫瘤細胞)及對照孔(含腫瘤細胞但不加化療藥物)，于5%CO2、37 ℃、95%濕度下孵育5～7 d。加入腫瘤細胞ATP提取液，混勻后室溫下15 min，取0.05 mL混合液置微板熒光分析儀檢測[11]。按下式計算各個化療藥物的抑制率：

抑制率=(1-試驗組ATP量/對照組ATP量)×100%。

抑制率≥70%為高度敏感；50%～70%為敏感；30%～50%為低度敏感；<30%為耐藥；當抑制率≥50%時可以推薦臨床使用。

2 結果

2.1 ATP標準曲線[10](用于質控，用于每次使用系統時的發光測試及實驗結果異常時的校驗)。取各濃度測得的發光均值，以稀釋濃度的LG對數值為自變量，以測定結果均值的LG對數值為因變量繪制標準曲線確定線性度，在ATP標準品濃度10-11～10-6mol/mL范圍內，2者呈良好的直線相關關系(r≥0.975，P<0.001)。

2.2 ATP生物發光法檢測結果 在總共收集的41例患者中，41例均具有可評估性。總可評估率約為：100%。在血漿峰值濃度下藥物對宮頸鱗癌與腺癌的抑制率見表2。

表2 血漿峰值濃度下藥物對鱗癌與腺癌的抑制率均值±s，%)

另外，宮頸腺泡狀橫紋肌肉瘤1例的癌細胞藥物的敏感性：TAX單藥為高度敏感，TAX+CBP方案為敏感，DDP+CTX+ADM方案為低度敏感，其余均為耐藥。

宮頸癌不同病理類型藥物敏感性的差異根據SPSS軟件統計P=0.3360，差異無統計學意義。

資料收集的41例宮頸癌細胞在不同濃度梯度下8組藥物的腫瘤生長抑制率見表3，8組化療藥物對宮頸癌細胞體外敏感試驗結果對照見圖1。

表3 不同濃度梯度下8組藥物的腫瘤生長抑制率均值±s，%)

圖1 8組化療藥物對宮頸癌細胞體外敏感試驗結果Fig.1 Chemosensitivities of cervical carcinoma to eight anticancer drugs

試驗結果顯示：本試驗的8組化療藥物隨著濃度增加，對腫瘤細胞敏感率也逐漸增加。分別在5個藥物濃度下，對各組藥物作用下腫瘤細胞生長的抑制作用之間兩兩比較，進行單因素方差分析，統計結果顯示均P<0.01，從而得出結論：8組化療藥物對個體宮頸癌細胞的抑制作用具有顯著性差異，血漿峰值濃度下腫瘤生長抑制率依次為：紫杉醇+順鉑>紫杉醇+卡鉑>紫杉醇>吉西他濱+順鉑>順鉑+環磷酰胺+多柔比星>托泊替康+順鉑>多西他賽>吉西他濱。

3 討論

經典的的宮頸癌化療方案一般選擇：BVP(博來霉素、長春新堿與順鉑)、BP(博來霉素與順鉑)、FP(氟尿嘧啶與順鉑)或者TP(紫杉醇與順鉑)。經驗性選擇化療方案對宮頸癌細胞幾乎沒有選擇特異性，因而療效低，同時易產生嚴重不良反應[12]；但是臨床上大多憑經驗用藥，同一化療方案固定不變應用于許多患者而忽視了個體差異，總體療效不佳。本研究采用ATP生物熒光法[6]對41例宮頸癌患者的腫瘤細胞進行藥敏試驗，結果顯示隨著藥物濃度的增大，腫瘤細胞對各抗癌藥物的敏感性增加，呈劑量依賴性。在患者可耐受的前提下可優先選擇TAX+DDP方案，其次為TAX+CBP和單藥TAX方案。有些患者的腫瘤細胞對某些藥物非常敏感，在濃度為50%PPC時就表現為高度敏感；而有些細胞則表現出耐藥，但隨著檢測藥物濃度的增加，當在濃度達200%PPC甚至更高時，細胞則表現出敏感。表明增加藥物劑量可以提高療效，這對于能夠耐受大劑量化療的患者有較好的指導意義。參與本試驗的41例宮頸癌患者，其腫瘤細胞對于各組化療藥物的敏感性均不完全相同。Ling ZQ等[13]報道對食管癌患者進行體外藥敏試驗為臨床治療提供合理的抗癌方案。O’Toole SA等[14]采用MTS法檢測子宮內膜癌以及宮頸癌患者對化療藥物的敏感性，并對比藥敏試驗結果與臨床療效，發現2者具有較好的相關性。因此，在臨床選擇化療方案前進行體外藥物敏感試驗，檢測患者腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，根據藥敏試驗結果選擇合適化療方案，可以顯著提高治療療效，減少不良反應及預防多重耐藥發生，從而延長患者生存期。

本研究也存在一些不足之處，抗癌藥物的療效是許多作用的綜合結果，受體內諸多因素的調控和制約，體外細胞生長環境無法完全模擬腫瘤體內環境，藥敏試驗只是藥物和細胞的直接作用，僅反映了腫瘤一個階段，一部分細胞的情況，無法完全體現腫瘤的異質性；臨床效果受用藥方法、劑量影響很大，體內的藥物濃度及持續時間受給藥途徑、肝腎功能等各種因素影響，而試驗條件則無法選擇合適的濃度和作用時間以達到與臨床完全一致；某些藥物需經代謝轉化或免疫系統介導發揮作用，如環磷酰胺[15]需經過肝臟代謝轉化為有效物質發揮作用，而體外藥敏試驗無法很好體現這些藥物功效。另外，據本研究結果顯示宮頸癌不同組織病理學間的藥物敏感性差異不具有統計學意義，可能與宮頸腺癌的樣本量少有關，有待后期繼續收集樣本資料，完善實驗結果。

[1] 王平，彭芝蘭，張家文，等.子宮頸癌新輔助化療中不同化療途徑的療效比較[J].中華婦產科雜志，2005，40(4)：227-230.

[2] 王立峰，劉寶瑞.鉑類、紫杉類藥物個體化治療研究進展[J].癌癥進展，2011，9(5)：533.

[3] 沈曉燕，崔恒.復發性和轉移性子宮頸癌化療的研究進展[J].中華婦產科雜志，2013，48(10)：788-791.

[4] Leath CA,Straughn JM.Chemotherapy for advanced and recurrent cervical carcinoma:results from cooperative group trials[J].Gynecologic oncology,2013,129(1):251-257.

[5] 安云婷，李隆玉，鄧克華，等.紫杉醇聯合順鉑/卡鉑在宮頸癌新輔助化療中的作用[J].實用癌癥雜志，2007，21(5)：499-501.

[6] Kurtz JE,Freyer G,Joly F,et al.Combined Oral Topotecan plus Carboplatin in Relapsed or Advanced Cervical Cancer:A GINECO Phase I-II Trial[J].Anticancer research,2012,32(3):1045-1049.

[7] 沈連強，張國玲.吉西他濱介入治療晚期和中晚期宮頸癌58例臨床觀察[J].蘇州大學學報(醫學版)，2003(6)：800-801.

[8] 李學真，鄒文，李敏，等.多西他賽聯合卡鉑同步放化療門診治療中晚期宮頸癌的近期療效觀察[J].中國全科醫學，2012，15(30)：3523-3525.

[9] 肖軍霞.多柔比星對人宮頸癌 Hela 細胞凋亡的形態學觀察[J].中華腫瘤防治雜志，2009，16(22)：1749-1752.

[10] 陳歷排.用微量板 ATP 生物發光法檢測腫瘤細胞對化療藥物的敏感性[J].腫瘤，2000，20(2)：103-105.

[11] Sevin BU,Peng ZL,Perras JP,et al,Averette HE.Application of an ATP -bioluminescence assay in human tumor chemosensitivity testing[J].Gynecol Oncol,1988,31:191 -204.

[12] Arias JL.Drug targeting strategies in cancer treatment：an overview[J].Mini Rev Med Chem,2011,11(1):1-17.

[13] Ling ZQ,Qi CJ,Lu XX,et al.Heterogeneity of chemosensitivity in esophageal cancer using ATP-tumor chemosensitivity assay[J].Acta Pharmacol Sin,2012,33(3)：401-406.

[14] O’Toole SA,Sheppard BL,McGuinness EP,et al.The MTS assay as an indicator of chemosensitivity/resistance in malignant gynaecological tumors[J].Cancer Detect Prev,2003,27(1)：47-54.

[15] Xiao Y,Li JD,Shi HL,et al.Predictive value of in vitro MTT assay chemosensitivity test of cytotoxic drug activity in cervical cancer[J].chin J cancer,2007,26(4):386-389.

(編校：譚玲，王儼儼)

Study on susceptibility of eight common chemotherapy drug combinations in human cervical carcinoma cell in vitro

ZHOU Ying,HU Jian-ming

(Department of Gynecology and Obstetrics, The First Affiliated Hospital of Soochow University, Suzhou 215006, China)

ObjectiveTo evalute chemosensivtivity of cervical pro-genetation turercells to eight common chemotherapy dnig combinations.Methods41 fresh specimens of human cervical tumors were selected in the first affiliated hospital of Soochow university from June 2013 to October 2014, then the cells were cultured.The sensitivity of combinations were tested using ATP-bioluminesence method: taxol (TAX), TAX+cisplatin (DDP), TAX+carboplatin (CBP), topotecan+DDP, gemcitabine (GEM)+DDP, docetaxel, GEM and DDP+cyclophosphamide (CTX)+doxoru (ADM) in different concentrations[200%, 100%, 50.0%, 25.0%, 12.5% plasma peak concentration (PPC)].ResultsThe chemosensitivities priority of cervical carcinoma to eight anticancer drugs in plasma peak concentration: TAX+DDP>TAX+CBP>TAX>GEM+DDP>DDP+CTX+ADM> Topotecan+DDP>Docetaxel>GEM. ConclusionThe ATP-bioluminesence assay in vitro can predict chemotherapy for cervical carcinoma, which has practical guidance for individual chemotherapy.

cervical carcinoma; pro-generation tumor cells; chemotherapy drugs; susceptibility; cultivation in vitro

周影，女，碩士，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:snow.zy131@163.com；胡建銘，通訊作者，女，學士，主任醫師，研究方向：婦科腫瘤，E-mail:hu_jm2001@163.com。

R737.3

A

1005-1678(2015)01-0057-03