免疫性肝纖維化大鼠血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度的相關性研究

張姣麗,賈小芳,尹林,馮艷玲,呂建新,張麗軍

(1.上海市公共衛生臨床中心，上海 201508；2.溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

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免疫性肝纖維化大鼠血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度的相關性研究

張姣麗1,2,賈小芳1,尹林1,馮艷玲1,呂建新2,張麗軍1,2

(1.上海市公共衛生臨床中心，上海 201508；2.溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

目的 探討血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度的相關性。 方法 通過注射豬血清構建不同分期大鼠肝纖維化模型。采用Agilent 1100，通過高效液相色譜法(high performance liquid chromatograph，HPLC)測定大鼠血漿中的氨基酸濃度。利用統計學方法分析血漿氨基酸濃度與肝纖維化程度之間的相關性。結果 根據柱前衍生高效液相色譜法測定的大鼠血漿中16種游離氨基酸含量及Spearman等級相關分析和方差分析發現：血漿組氨酸(histidine，His)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、蘇氨酸(threonine，Thr)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、纈氨酸(valine，Val)等與肝纖維化程度具有相關性(His:rs=0.512,P=0.015; Phe:rs=0.713,P<0.01; Thr:rs=0.567,P=0.006; Tyr:rs=0.753,P<0.01; Val:rs=0.508,P=0.016)； His 、Phe和Tyr在不同肝纖維化病理分期中的濃度均與正常組有統計學差異，但在不同病理分期間無統計學差異。結論 血漿中His 、Phe和Tyr濃度與肝纖維化程度正相關，但對肝纖維化病理分期無判別意義。

肝纖維化；氨基酸；HPLC

肝臟是人體最大的消化器官，肝臟疾病嚴重影響著人類身體健康。在中國，約有近6億乙肝病毒(hepatitis B virus，HBV)感染者， 其中1.3億為HBV攜帶者，而約有3億是肝炎(hepatitis B，HB)患者。每年近30萬人死于肝硬化和肝癌等肝臟疾病, 其中約50%死于肝癌[1-2]。大多數肝臟疾病都會經歷由肝炎、肝纖維化到肝硬化甚至肝癌的病理過程，其中肝纖維化是逆轉病情的一個關鍵階段。因此，早期診斷治療肝纖維化具有顯著的意義。而目前肝纖維化的診斷主要依賴病理結果，無創的早期診斷仍然缺乏。血漿中由各種氨基酸及其濃度組成的氨基酸譜，即氨基酸模式，蘊涵著反映機體代謝和功能狀態的重要生物化學信息，對慢性肝病疾病狀態的診斷具有診療意義。但是由于臨床研究很難動態觀測肝纖維化的整個發展過程，使得尋找肝纖維化早期診斷分子比較困難。免疫性肝纖維化模型[3-5]因能夠很好地模擬HBV引起的慢性肝臟損傷而被廣泛用來進行肝纖維化的研究。在眾多免疫性肝纖維化模型中，由豬血清注射于大鼠后，引起的肝門靜脈周圍單核細胞滲入和纖維化應答與人類非常相似，因此被應用得最為廣泛。很多研究工作者采用該模型[6]研究人類肝纖維化疾病, 尤其是由HBV引起的肝纖維化[7]。因此，本研究擬通過建立大鼠肝纖維化模型系統性研究該模型肝纖維化演變中氨基酸的動態變化過程，旨在探討血漿氨基酸與肝纖維化程度的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠40只，體質量180～200g，由上海市公共衛生臨床中心提供，實驗動物許可證號：SCXK(滬)2010-0024， 本實驗遵循《實驗動物保護條例》。動物飼養于清潔級動物實驗室內，24 ℃恒溫、恒濕及12 h節律光照，普通鼠飼料喂養，自由進食。

1.2 主要儀器與試劑 Agilent 1100系列高效液相色譜儀(high performance liquid chromatograph，HPLC)，BACKMAN COULTER 臺式高速冷凍離心機(美國Beckman公司，Microfuge 22R)；Eppendorf 微量移液器，純乙腈(acetonitrile，ACN)、甲醇(MeOH) 購自美國Merck公司，甲酸(FA) 購自美國Fluka 公司，四氫呋喃購自美國Fisher公司，醋酸、硼酸、醋酸鈉、三乙醇胺購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型構建:雄性SD大鼠40只，分籠飼養1周后應用隨機數字表進行完全隨機化分組，將大鼠分為實驗組和對照組，每組20只，共8籠。免疫性肝纖維化動物模型構建方法與本實驗室已發表的文章[8]相同，即每周給予實驗組每只大鼠腹腔注射0.5 mL豬血清2次，而對照組大鼠則予以同等體積的生理鹽水，一直持續8周。分別于造模的第2、4、6和8周，從大鼠股動脈抽取約2.0 mL血液于EDTA抗凝管中。取血后即采用安樂死的方法處死大鼠，并從腹腔取出肝臟組織保存于10%甲醛中送病理科做HE染色切片，以判斷不同造模時期的肝臟病理變化。

1.3.2 氨基酸濃度檢測標準品溶液：使用日本Agilent公司生產的氨基酸分析標準品，該標準品共有5個濃度，分別為10、25、100、250和1000 nmol/μL。每種標準品含17種標準氨基酸：天門冬氨酸(Asp)，谷氨酸(Glu)，絲氨酸(Ser)，組氨酸(His)，甘氨酸(Gly)，蘇氨酸(Thr)，丙氨酸(Ala)，精氨酸(Arg)，酪氨酸(Tyr)，胱氨酸(Cys-SS-Cys)，纈氨酸(Val)，蛋氨酸(Met)，苯丙氨酸(Phe)，異亮氨酸(Ile)，亮氨酸(Leu)，賴氨酸(Lys)和脯氨酸(Pro)。

樣品溶液制備：將上述采集于 EDTA抗凝管中的大鼠血液，放于4 ℃冰箱靜置1 h后，精確吸取100 μL血漿樣品于新的干凈EP管，并加入4倍體積的無水甲醇，充分混勻后，再次放入4 ℃冰箱靜置30 min。 4 ℃，12000 r/min，離心20 min后留取上清，重復離心1次，取100 μL上清即樣品溶液進行上樣。

色譜條件：Agilent 1100系列高效液相色譜儀，由四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱和DAD二極管陣列檢測器組成。使用Agilent Hypersil AA-ODS色譜柱(2.1×200 mm，5 μm)和保護柱；流動相 A(500 mL)：20mM NaAc+18%TEA+0.3%四氫呋喃,用1%～2%醋酸調節pH值至7.2，流動相B (500 mL)：20% 100mM NaAc(用1%～2%醋酸調節pH值至7.2)+40% ACN+40%MeOH；線性梯度：0 min 100% A，流速0.45；17 min時60%B，18 min時100%B，18.1 min時流速0.45，18.5 min時流速0.8，23.9 min時流速0.8，24 min時100%B，流速0.45，25 min時0%B；使用DAD UV檢測器，信號A=338/10 nm， 參考=390/20 nm；柱溫設為 40 ℃。采用在線衍生技術，將衍生試劑OPA、FMOC、0.4N硼酸緩沖液(pH 10.4)及ddH2O分別放入自動進樣器的1、2、3、4位，并將處理好的樣品按照進樣順序依次放置進樣器中相應的空位。

設置自動進樣器的進樣程序，具體如下：從3號瓶中吸取5.0 μL硼酸緩沖液；從1號瓶中吸取1.0 μL(OPA試劑；從4號瓶中吸取1.0 μL(水；從Sample瓶中吸取樣品；從4號瓶中吸取1.0 μL-水； 8 μL液體原位混合，最大速度，6次；從2號瓶中吸取1.0 μL-FMOC；從4號瓶中吸取1.0μl-水；9 μL原位混合，最大速度，3次；進樣。

2 結果

2.1 大鼠肝組織病理學檢測結果 免疫性肝纖維化模型由本實驗室成功構建。血清注射2周后， 在中央區發現有少量炎癥細胞濾過和纖維細胞形成，被診斷為肝纖維化S0～S1；第4周，炎性細胞浸潤并纖維組織輕度增生，部分區域維隔形成，肝纖維化發展為S2；第6周，炎細胞和纖維組織增多，維隔形成較纖細，可見分隔的假小葉診斷為肝纖維化S3～S4； 到第8周，切片中可見非常明顯的維隔和假小葉，個別小鼠在本周期出現腹水，診斷為肝纖維化S4，而正常組的肝組織沒有病理改變(見圖1)。

圖1 大鼠肝組織病理結果ILF:實驗組；NOR：正常組Fig.1 Histopathological results of rat liver fibrosis ILF:experiment group;NOR:normal group

2.2 標準品16種氨基酸色譜分離結果 通過柱前衍生法，Agilent 1100高效液相色譜法能同時檢測標準品中16種目的氨基酸(見圖2)，(1=Asp，2=Glu，3=Ser，4=His， 5=Gly， 6=Thr，7=Ala，8=Arg，9=Tyr，10=Cys-SS-Cys，11=Val，12=Met，13=Phe，14=Ile，15=Leu，16=Lys，17=Pro)。且該16種氨基酸在15 min內即能得到很好的分離。可見該方法具有靈敏度高，血漿樣品需要量少(一般只要50～100 μL樣品)，分析速度快(每30 min分析一個樣品)，重復性好等優點，適用于動物模型樣本的研究。

圖2 氨基酸標準品色譜分離圖譜Fig.2 Amino acid profiles of chromatographic separation from the standard sample

2.3 血漿氨基酸濃度與肝組織病理分期之間的相關性通過柱前衍生高效液相色譜法測定了大鼠血漿中以上16種游離氨基酸含量，對大鼠血漿氨基酸含量與肝組織病理分期之間進行相關性分析，發現：Ala、Leu、BCAA/AAA 與肝組織病理分期呈低度正相關性;His、Phe、Thr、Tyr、Val、Met與肝組織病理分期呈中度正相關性；Arg、Asp、Cys-SS-Cys、Glu、Gly、Ile、Lys、Ser與肝組織病理分期不相關(見表1，*表示有統計學差異的氨基酸)。

表1 大鼠血漿氨基酸濃度與肝組織病理分期之間的Spearman相關系數±s，nmol/μL)

2.4 血漿氨基酸濃度在不同肝組織病理分期的動態變化結果 采用SPSS軟件對柱前衍生高效液相色譜法測定的大鼠血漿中游離氨基酸含量進行單因素方差統計分析發現：在正常對照組及2、4、6、8周免疫性肝纖維化大鼠的血漿中具有統計學差異(P<0.05)的氨基酸為：Ala、Arg、Asp、His、Leu、Phe、Thr、Tyr和Val(見表2)。對有差異的氨基酸，進一步進行組間比較分析，其中Ala在正常組與第2周之間差異有統計學意義(P=0.028)、Asp在第6周與第8周之間差異有統計學意義(P=0.032)、Thr在正常組與第4周之間差異有統計學意義(P=0.045)、Tyr在正常組與第2、4、6、8周之間差異有統計學意義(P=0.000、0.000、0.000、0.000)、Val在正常組與第4、8周之間差異有統計學意義(P=0.034、0.032)、His在正常組與第2、4、6、8周之間差異有統計學意義(P=0.006、0.013、0.034、0.03)、Phe在正常組與第2、4、6、8周之間差異有統計學意義(P=0.032、0.029、0.015、0.015)。

表2 大鼠血漿氨基酸濃度在不同病理分期之間的差異±s，nmol/μL)

3 討論

肝臟是人體的中心代謝器官，能分解人體內所有氨基酸，在氨基酸代謝中具有極重要的地位。當肝臟發生疾病時，血漿中氨基酸的變化也倍受到關注。Fischer[9]等人首先發現支鏈氨基酸/芳香族氨基酸摩爾比值與肝性腦病的發生有關，并將其應用于肝性腦病的診斷。隨后的研究也進一步表明慢性重型肝炎伴有肝性腦病者具有特征性血清氨基酸譜，表現為芳香族氨基酸(AAA，包括苯丙氨酸、酪氨酸)升高，支鏈氨基酸(BCAA，包括亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)降低[10- 11]。與此同時，慢性肝功能不全、肝硬化病人血漿中色氨酸的變化也受到重視，因其與肝性腦病的發生率密切相關。最近，Michitaka 等檢測了不同病因慢性肝炎患者的血漿中支鏈氨基酸和酪氨酸的濃度，發現支鏈氨基酸和酪氨酸的濃度比值隨慢性肝組織炎癥程度和纖維化程度增加而出現定向變化，對判別肝臟炎癥活動度和肝纖維化程度有一定的臨床診斷價值[12]。可見，氨基酸模式的變化與肝臟性疾病狀態存在著一定的聯系。但是，血漿氨基酸模式變化是否與慢性乙性肝炎引起的肝纖維化程度具有相關性，到目前為止尚無確論。

為了進一步明確血漿氨基酸對肝纖維診斷的價值，本研究建立了大鼠肝纖維化模型并利用Agilent 1100高效液相色譜法測定大鼠血漿中16種氨基酸含量。經肝組織病理學證實，不同分期的大鼠肝纖維模型被成功構建。在肝纖維化不同分期狀態下檢測血漿中氨基酸含量，經研究分析發現組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)、蘇氨酸(Thr)、酪氨酸(Tyr)、纈氨酸(Val)等與肝纖維化程度具有相關性，進一步分析發現His 、Phe和Tyr在不同肝纖維化病理分期中的濃度均與正常組有統計學差異，在不同病理分期間卻無統計學差異；提示血漿氨基酸濃度有助于判別肝組織正常狀態與肝纖維病理狀態，但不能區分肝纖維化的病理分期。組氨酸(His)、苯丙氨酸(Phe)酪氨酸(Tyr)屬于芳香族氨基酸，亮氨酸、異亮氨基酸、纈氨酸屬于支鏈氨基酸。本研究肝纖維化模型中芳香族氨基酸和支鏈氨基酸都表現出下降趨勢，這與臨床上慢性肝病、肝硬化尤其是肝性腦病患者血漿氨基酸模式即芳香族氨基酸上升，支鏈氨基酸降低不太一致。研究還將此次大鼠模型的研究結果與同樣研究乙型肝炎相關性肝纖維化的臨床研究結果[13]進行了比較，結果卻發現：在肝纖維化前期，臨床乙型肝炎相關肝纖維化患者的Phe和Tyr的變化趨勢與免疫性大鼠模型的變化趨勢基本一致。在此之前，Morgan[14]等對不同病因慢性肝病患者的血漿氨基酸模式也進行了比較分析，發現慢性活動型肝炎 、病毒性肝炎 、 隱源性肝炎、酒精性肝炎或肝硬化 、原發性膽汁性肝硬化 、 酒精性脂肪肝的血漿氨基酸模式的變化不完全一致。因此導致本研究這種結果的原因可能與不同病因慢性肝病患者血漿氨基酸模式的變化存在差異有關。

盡管多種致病因素造成的肝臟損傷導致氨基酸變化的機制較為復雜。根據本研究初步分析，血漿His 、Phe和Tyr濃度與慢性乙型肝炎相關性肝纖維存在著正相關，但其診斷慢性乙型肝炎相關性肝纖維化程度的臨床價值還有待評估。利用血漿氨基酸變化趨勢診斷慢性乙型肝炎肝組織病理狀態的實踐價值還需要進一步評估和優選。

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(編校：譚玲)

Correlativity analysis between plasma concentrations of amino acids and liver fibrosis progression in immune hepatic fibrosis model

ZHANG Jiao-li1,2,JIA Xiao-fang1,YIN Lin1,FENG Yan-ling1,LV Jian-xin2,ZHANG Li-jun1,2

(1.Shanghai Public Health Clinical Center, Shanghai 201508, China; 2.School of Laboratory Medicine and Science,Wenzhou Medical University, Wenzhou 325035, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between plasma amino acid concentration and the degree of liver fibrosis.MethodsRats were administrated with swine serum to induce different stages of liver fibrosis. Plasma concentrations of amino acids were determined by the Agilent 1100 high performance liquid chromatography (HPLC) and the correlation between the plasma amino acid concentration and the liver fibrosis progress was studied by statistical method.Results16 kinds of amino acids in serum of rats were measured by HPLC pre-colum derivatization.According to the analysis of correlation and variance, histidine, phenylalanine, threonine, tyrosine and valine were related with liver fibrosis progression(His:rs=0.512,P=0.015; Phe:rs=0.713,P<0.01; Thr:rs=0.567,P=0.006; Tyr:rs=0.753,P<0.01; Val:rs=0.508,P=0.016).There were significant differences of His,Phe and Tyr concentration between liver fibrosis at different pathological stages and normal group, but no significant difference between the different pathological stages. ConclusionThe concentration of His, Phe and Tyr in plasma has positive correlation with the liver fibrosis progress, but have no discriminant significance for pathological stage.

hepatic fibrosis; amino acid; HPLC

國家自然科學基金(81271834)；國家重點基礎研究計劃(2011CB910700)；重大新藥創制(2012ZX09303013)

張姣麗，女，碩士在讀，研究方向：結腸癌蛋白質組學研究，E-mail：15000388915@163.com；張麗軍，通訊作者，女，博士，研究員，研究方向：藥代動力學及蛋白質組學，E-mail：zhanglijun1221@163.com。

R3

A

1005-1678(2015)01-0052-05