軟骨素酶ABC誘導大鼠尾椎間盤退變的實驗研究

王炎,王琨,吳小濤

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.東南大學附屬中大醫院 骨科，江蘇 南京 210009)

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軟骨素酶ABC誘導大鼠尾椎間盤退變的實驗研究

王炎1,2,王琨1,2,吳小濤1,2

(1.東南大學 醫學院，江蘇 南京 210009；2.東南大學附屬中大醫院 骨科，江蘇 南京 210009)

目的 探討軟骨素酶ABC(chondroitinase ABC，ChABC)誘導SD大鼠椎間盤退變動物模型的穩定性及可行性。方法 80只雄性SD大鼠，隨機分為7天組和30天組，每組40只，取濃度為0.25 unit/mL ChABC 0.1 mL，注入(coccygeal vertebrae，Co7/8)椎間盤作為造模組，(coccygeal vertebrae，Co6/7)近端椎間盤不作處理作為對照組。術后第7天、第30天行尾椎7.0T磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)，取標本行HE染色，阿爾新藍染色，馬森三色染色及Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組織化學，觀察椎間盤退變情況。結果 MRI結果顯示：術后第7天，第30天，對照組Co6/7椎間盤T2信號強度均未見明顯變化，而造模組Co7/8椎間盤T2信號強度均明顯降低，Co7/8與Co6/7椎間盤T2信號值差異具有統計學意義(P<0.05)，兩時間點Co7/8椎間盤T2信號值比較差異無統計學意義；術后第7天和第30天，HE染色，阿爾新藍染色，馬森三色染色提示Co7/8椎間盤均出現明顯退變，Co7/8椎間盤Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組織化學積分光密度值均較Co6/7椎間盤顯著降低(P<0.05)。結論 軟骨酶素ABC誘導構建大鼠尾椎間盤退變模型是一種簡單有效、重復性好的建模方法。

椎間盤退變；軟骨素酶ABC；動物模型

隨著生活節奏和人類作息習慣等各種因素的改變，下腰痛的發病率呈逐年上升趨勢，腰間盤退行性病變作為下腰痛的主要致病因素也已得到了醫學界的廣泛認可[1]。腰間盤退行性病變的發病誘因較多，截至到目前仍未能完全明確其發病機制，這也為其臨床診治帶來了諸多障礙[2]。動物模型由于具有樣本獲取速度快、實驗對象數量大等優點，在各類疾病的發病機制及臨床診治的基礎研究中發揮著重要作用。鑒于腰間盤退行性病變發病機制的復雜性，借助動物模型則可為腰間盤疾病的診治提供充足的臨床基礎資料，且可避免危及患者的生命健康。

目前建立椎間盤退變模型的方法包括：機械干預法、外傷、酶化學法、缺血、基因敲除、吸煙等[3]，本實驗通過向SD大鼠尾椎間盤注入軟骨素酶ABC(chondroitionase ABC,ChABC)建立椎間盤退變的動物模型，通過7.0T磁共振及組織學染色及免疫組化觀察，探討建立腰間盤退行性病變動物模型的穩定性及可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級SD大鼠80只，雄性，平均月齡2個月，平均體質量(300±50)g，由東南大學醫學院實驗動物中心提供，生產許可證編號：SCXK2014-0007；使用許可證編號：SYXK(蘇)2014-0035)，實驗遵循《實驗動物保護條例》。隨機分為第7天、第30天造模組，共2組，每組各40只。分別按標準飼養條件下單籠飼養，飼養室室溫控制在25 ℃左右，食物和飲用水充足。

1.2 試劑與儀器 HE染色，阿爾新藍染色，馬森三色試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司)；免疫組織化學染色試劑盒(福州邁新生物科技有限公司)；大鼠Ⅱ型膠原和蛋白多糖抗體(ABCAM)。

Bruker 7.0T小動物磁共振成像儀、切片機(美國Reichert HistoSTAT)；顯微鏡(Olympus)、超凈工作臺(蘇州凈化)。

1.3 動物模型的建立 用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射，麻醉成功后，將動物俯臥于手術臺上，四肢固定。尾部備皮，碘伏消毒手術區域。模型組尾部正中縱向切口，依次切開皮膚和筋膜，暴露椎間盤。選取尾椎第6～7(coccygeal vertebrae，Co6/7)，7～8(coccygeal vertebrae，Co7/8)椎間盤用于本次研究，將0.1 mL軟骨素酶ABC(0.25 unit/mL)注入到Co7/8椎間盤，Co6/7近端椎間盤不作處理作為對照。術后立即給予每只SD大鼠青霉素5萬U肌注。

1.4 影像學檢查 2組動物分別于術后第7天、30天麻醉后采用BRUKER公司7.0T磁共振掃描(magnetic resonance imaging，MRI)檢查。自旋回波(spin echo，SE)序列掃描參數：矢狀面T2—重復時間4000 ms，回波時間1 ms，視野10.60，層面厚度0.94 mm，層面數9，均值4 mm；T2 map—重復時間2500 ms，回波時間16 ms，視野8.00，層面厚度1 mm，層面數9，均值1 mm。掃描后通過隨機軟件采用最小二乘法獲得T2map圖像，并測量Co6/7、Co7/8椎間盤的T2信號值。

1.5 組織學染色 MRI檢查結束后處死所有大鼠，完整取出Co6/7，Co7/8椎間盤，4%的中性福爾馬林溶液室溫下固定24 h，pH=7.4，10%的EDTA脫鈣30 d。透明處理后石蠟包埋，椎間盤連續性切片，制備成厚度5 μm的切片，行蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin, HE)染色，阿爾新藍(alcian blue)染色，馬森三色(Masson trichrome)染色。光鏡下觀察椎間盤形態的變化。

1.6 免疫組化檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達 新鮮標本用生理鹽水沖洗 2～3遍，行OCT冷凍包埋，冰凍切片機橫斷面連續切片，每個節段椎間盤做成5張切片，每張厚約5～6 μm，選擇結構較為完整的2張切片進行Envision染色，在400倍光學顯微鏡下觀察組織細胞中Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達情況并拍照，使用美國Media Cybernetics公司專業圖片分析軟件Image-Pro Plus 6.0得出Ⅱ型膠原和蛋白多糖積分光密度值(integrated optical density，IOD)。

2 結果

2.1 影像學結果 對照組術后第7天，第30天Co6/7椎間盤T2信號強度均未見明顯變化，而造模組Co7/8椎間盤T2信號強度均明顯降低，T2值分別為(50.26±11.97)ms和(49.32±12.01)ms，Co7/8與Co6/7椎間盤T2信號值差異具有顯著統計學意義(P<0.05)。造模組術后第7天與第30天的Co7/8椎間盤T2信號值比較差異無統計學意義。見圖1。

圖1 術后第7天和第30天的SD大鼠尾椎間盤的磁共振結果Fig.1 MRI results of rats spinal disc at the seventh day and thirtieth day after operation

2.2 組織學染色結果 術后第7天和第30天，對照組Co6/7椎間盤HE染色展現清晰的椎間盤界限，椎間盤中央區髓核可見清晰的基質，較多的脊索細胞和類軟骨細胞且排列均勻，細胞數目多，增殖活躍。類軟骨細胞較小，間質不均勻并呈紅色，可存在于軟骨陷窩內。而術后第7天、30天，造模組Co7/8椎間盤HE染色可見髓核的脊索細胞及軟骨樣細胞減少，纖維環與髓核之間的界限模糊，炎性細胞浸潤、軟骨細胞增生、粘液樣退變、細胞死亡、裂隙形成以及顆粒樣改變。術后第7天和第30天對照組中，Co6/7椎間盤的髓核中阿爾新藍強染色，而馬森三色弱染色，這提示髓核中存在大量的蛋白多糖，少量的膠原；在纖維環中相反，馬森三色強染色，能很清晰地顯示椎間盤板層結構，而阿爾新藍弱染色。術后第7天和第30天，造模組Co7/8椎間盤大量藍染物質紊亂，丟失，纖維細胞增生，維環板層結構紊亂。見圖2。

圖2 組織學染色結果Fig.2 Results of histological staining

2.3 Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化結果 與對照組比較，造模組術后第7天和第30天Co6/7椎間盤Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化IOD均降低，差異具有統計學意義(P<0.05)。而造模組術后第7天和第30天Co7/8椎間盤Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化IOD差異無統計學意義，見表1。所有染片背景染色清晰，Ⅱ型膠原和蛋白多糖陽性反應呈棕褐色，主要位于胞漿內。所有切片均廣泛表達Ⅱ型膠原和蛋白多糖，Co6/7椎間盤高表達，而Co7/8椎間盤相對低表達，見圖3。

表1 Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化IOD結果±s)

*P<0.05，與對照組相比，compared with control group

圖3 術后第7天和第30天Ⅱ型膠原和蛋白多糖免疫組化染色結果(×400)Fig.3 Immunohistochemistry staining results of collagen typeⅡ and proteoglycan atthe seventh day after operation and thirtieth day(×400)

3 討論

椎間盤病變作為下腰痛的主要病因，其病變程度成退行性加重，在當前的醫療條件下很難有效阻止或逆轉已發生器質性損傷的椎間盤病變。無論是外科手術或是牽引、按摩等治療方式，在一定程度上僅能緩解椎間盤病變的癥狀，欲完全解除癥狀或修復損傷較為困難。隨著醫療科技的不斷發展，近年來可以通過注射特殊生長因子、基因干預、細胞移植等手段及時干預退變的諸多環節[4]，因此有必要確立一種動物椎間盤退變的模型來評估新治療方法，而這種模型必須具備以下幾個特征[5]：①重復性好；②簡單易行；③能再現椎間盤退變的客觀規律；④選擇的動物在解剖生理上盡可能與人類相似。SD大鼠飼養方便、抵抗力強、價格低廉、椎間盤在解剖和生化結構上與人類椎間盤比較相似，可用于大規模實驗研究。本實驗，設計向SD大鼠尾椎間盤內注射軟骨酶素ABC來建立椎間盤退變的模型。

ChABC[6]是一種多糖酶，特異性降解某些糖胺聚糖側鏈，如硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、透明質酸等。髓核是由大量的糖胺聚糖高分子組成，向椎間盤內注射ChABC可以使髓核中的糖胺聚糖分子減少，糖胺聚糖分子的減少是人類椎間盤退變的早期變化之一，本實驗通過向SD大鼠尾椎間盤注射ChABC降低糖胺聚糖的含量，可以引起椎間盤變化，這一系列的變化模擬了人椎間盤退行性疾病的各個方面[7-8]，包括椎間盤磁共振T2信號降低；椎間盤組織結構紊亂；髓核不斷地斷裂、濾泡結構減少甚至消失；髓核細胞中蛋白聚糖和Ⅱ型膠原含量降低、纖維環板層結構紊亂等。

MRI技術可以作為檢查椎間盤形態一種可靠的手段，評價椎間盤退變的程度通常是按含水量分級的，而含水量可以被T2信號強度反應，Modic等[9]指出椎間盤T2信號的減弱與退變的程度相關。雖然T2加權像被用來評價椎間盤退變，但信號強度由于測定與放大因素不能得出具體值[10]，所以本實驗使用T2map來測量椎間盤水容量的T2值。本研究發現在造模第7天，造模椎間盤Co7/8磁共振T2信號顯著降低，T2值較對照組有顯著差異(P<0.05)。造模第30天與造模第7天相比，Co7/8磁共振T2信號差異無統計學意義。這為今后的研究提供了參考，向椎間盤注射ChABC制造椎間盤退變模型，在造模第7天就有顯著效果，相比其他造模方法時間更短，達到的實驗效果一樣。

HE染色、阿爾新藍染色、馬森三色染色可以從組織學的層面評價椎間盤退變的效果。阿爾新藍染色主要對蛋白聚糖敏感，馬森三色對膠原敏感[11-12]，可以用阿爾新藍染色反映髓核結構的變化，馬森三色反映纖維環結構的變化。在造模第7天、30天，本研究觀察到Co7/8椎間盤內髓核軟骨細胞減少，纖維細胞增生，組織壞死，玻璃樣變及纖維化，髓核毛細血管的侵入，炎性細胞的浸潤等；維環板層結構紊亂，軟骨細胞巢狀增生，纖維環粘液樣退變，纖維環裂隙形成；軟骨終板細胞減少，膠原纖維環聚集成片。與椎間盤退變相關的生物化學變化是細胞外基質的降解，細胞外基質的主要成分是膠原和蛋白多糖，椎間盤以Ⅱ型膠原為主，尤其是在髓核中。本實驗中發現在造模后第7天和第30天，Ⅱ型膠原和蛋白多糖的含量顯著減少，驗證了良好的造模效果。

本研究設計復制椎間盤退變的模型有很多優點：首先，操作簡單，尾椎間盤容易定位，造模的過程中大鼠死亡率、術后感染率低，研究人員可以在很短的時間內就熟練掌握該造模技術；其次，費用低，高效率，在造模的第7天就能產生很好椎間盤退變效果。但所有動物模型都有局限性，本實驗中雖然退變的其他特征是可控制的并且不矛盾，但是機械效應是直接的，不能代表人類椎間盤退行性疾病的自然緩慢進程。同時，與人類的椎間盤不同的是，大鼠自始至終都有脊索細胞，尾椎間盤與腰椎間盤有不同的生理機械負荷。因此，更加理想、經濟的動物模型的開發需要在未來工作中進一步探索研究。

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(編校：王冬梅)

Experiment study of rats model of coccygeal disc degeneration induced by chondroitinase ABC

WANG Yan1,2,WANG Kun1,2,WU Xiao-tao1,2

(1.Medical College of Southeast University, Nanjing 210009, China; 2.Department of Orthopaedics, Zhongda Hospital Affiliated to Southeast University, Nanjing 210009, China)

ObjectiveTo investigate the chondroitinase ABC (ChABC)stability and feasibility of intervertebral disc degeneration induced by SD in rat animal model.Methods80 male SD rats were selected and randomly divided into two groups, 40 in each group,which were the 7 days and 30 days after-lesion groups.Co7/8 disc were injected with ChABC (0.2 mL,0.25 unit/mL)as model group while Co6/7 were set as blank control.7.0 Tesla small animal MRI was performed after 7 days and 30 days after the operation.Subsequently,Co6/7 and Co7/8 in each rat were taken and underwent HE staining,Alcian blue staining and trichrom Masson staining.Additionally,immunohistochemical staining of type II collagen and proteoglycan were also performed.ResultsMRI results showed that at both 7 and 30 days after the injection of ChABC:Co6/7 disc T2 signal intensity had no obvious change in control group,Co7/8 had developed significant degeneration in model group,T2 signals in Co7/8 and Co6/7,the difference had statistical significance (P<0.05).However,T2 signals in Co7/8 groups between two times did not have statistical significance; HE staining,Alcian blue staining and Masson staining in the Co7/8 were all decreased significantly compared to Co6/7 in each group.IOD values of immunohistochemical staining of type II collagen and proteoglycan in Co7/8 were lower than Co6/7(P<0.05). ConclusionIt indicates that a rat model of coccygeal disc degeneration induced by ChABC is easy,effective and reproducible.

intervertebral disc degeneration; ChABC;animal model

王炎，男，碩士在讀，研究方向：脊柱疾病的臨床診治，E-mail：61607653@qq.com；吳小濤，通訊作者，男，博士生導師，主任醫師，研究方向：脊柱及其他骨科疾病的診治，E-mail：wuxiaotao@medmail.com.cn。

R681.5+3

A

1005-1678(2015)01-0014-04