響應面法優化葛根素提取工藝的研究

王 嬰，伍艷芬

（廣東藥學院醫藥化工學院，廣東中山528458）

響應面法優化葛根素提取工藝的研究

王 嬰，伍艷芬

（廣東藥學院醫藥化工學院，廣東中山528458）

目的優化葛根的提取工藝參數，提高葛根素的提取率。方法在單因素初篩的基礎上，以HPLC測定的葛根素含量為響應值，進行三因素三水平Box-Behnken試驗設計，并利用Design Expert軟件對試驗數據進行分析，得到響應面數據并分析結果。結果乙醇濃度與提取時間、提取時間與料液比、乙醇濃度與料液比之間均存在著交互作用。葛根素的最優提取條件為乙醇濃度78%，提取時間為143 min，料液比為1∶10。結論優化的工藝提取條件簡便，重現性良好，適用于葛根素的提取。

葛根素；中藥制藥工藝；工藝學；多元分析；乙醇

葛根為豆科植物野葛的干燥根，具有解肌退熱、生津止渴、通經活絡等功效，用于治療感冒發熱、熱痢、眩暈、頭痛等癥[1]。葛根中含有的異黃酮類成分具有降低心肌耗氧量、促進冠狀動脈循環、緩解心絞痛等多種藥理活性[2-4]。其中葛根素為主要有效成分，目前已有注射劑、片劑、膠囊等劑型上市，并成為臨床治療心腦血管病的一線用藥[5-6]。為提高葛根素的產率，本研究采用響應面法對葛根素的提取工藝進行了優化，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 2489高效液相色譜儀（美國Waters公司）；

C18 ODS色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；RE-52AA旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ3200超聲波清洗器（東莞市科橋超聲波設備有限公司）；SHZ-DⅢ循環水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）；FA2204B電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；TC-15恒溫水浴鍋（海寧市華星儀器廠）。

1.1.2 藥物與試劑 葛根素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：110752-200511）；甲醇（色譜純，天津市四友精細化學品有限公司）；95%乙醇為分析純；水為雙蒸水；中藥葛根購于廣州致信藥業有限公司，經廣東藥學院中藥資源系曾令杰教授鑒定為豆科植物野葛的干燥根。

1.2 方法

1.2.1 葛根素含量測定方法的建立

1.2.1.1 色譜條件及系統適應性試驗 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-水（32∶68）為流動相；檢測波長為250 nm；柱溫為室溫；流速為1.0 mL/min；進樣量為20 μL；理論板數按葛根素計算應不低于3 000[7-8]。

1.2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取葛根素對照品10.0 mg，置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。

1.2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取葛根最粗粉15 g，按響應面設計1號提取方案，按料液比1∶10加入80%乙醇，加熱回流2次，每次120 min，趁熱濾過，合并濾液，減壓濃縮至適量，轉移至25 mL量瓶中，加80%乙醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。

1.2.1.4 樣品測定 分別精密吸取對照品與供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，記錄圖譜。

1.2.1.5 線性關系考察 精密吸取葛根素對照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，分別進樣20 μL，測定峰面積，以峰面積Y為縱坐標，葛根素質量濃度X（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程。

1.2.1.6 精密度試驗 精密吸取濃度為0.2 mg/mL的對照品溶液20 μL，連續進樣6次，得葛根素峰面積的相對標準差（RSD）。

1.2.1.7 重復性試驗 精密稱取葛根最粗粉15 g，共取6份，按1.2.1.3項下方法分別制成供試品溶液。精密吸取20μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，計算含量的RSD。

1.2.1.8 穩定性試驗 取同一供試品溶液，分別于配制后0、2、4、6、8 h內，在1.2.1.1項色譜條件下測定，得葛根素峰面積的RSD。

1.2.1.9 回收率試驗 精密吸取已知葛根素含量的供試品溶液6份，每份1mL，每份加入質量濃度為0.02mg/mL的對照品溶液3 mL，混勻后，精密吸取20 μL，在色譜條件下測定，得平均回收率及RSD。

1.2.2 響應面設計 在單因素試驗的基礎上，根據Box-Behnken原理，以葛根素含量為響應值，對乙醇濃度、料液比及提取時間進行三因素三水平的試驗設計，以確定葛根素提取的最佳工藝參數[9]。見表1。

表1 響應面設計因素水平表

1.2.3 模型擬合與響應面優化 通過Design Expert 7.0.0軟件處理數據后，將響應值與各個因素進行回歸擬合，得回歸方程后，分別對其一次項、二次項和交互項進行方差分析，得出優選提取條件，并進行3批驗證試驗，以考察響應面結果的可靠性。

2 結 果

2.1 葛根HPLC色譜圖 HPLC圖譜顯示，葛根素峰形尖銳，與其他成分分離情況良好。見圖1。

圖1 葛根HPLC色譜圖

2.2 線性關系考察 回歸方程為Y=9.7×107X-2.6×105，r=0.999 5，表明葛根素質量濃度在0.02～0.20 mg/mL線性關系良好。

2.3 精密度試驗 葛根素峰面積的RSD為0.39%，表明儀器精密度良好。

2.4 重復性試驗 葛根素含量的RSD為1.06%，表明該方法重現性良好。

2.5 穩定性試驗 葛根素峰面積的RSD為1.02%，表明供試品溶液在8 h內基本穩定。

2.6 回收率試驗 平均回收率為98.54%，RSD為0.86%，表明本法具有良好的準確度。見表2。

表2 回收率試驗結果

2.7 模型擬合與響應面優化 回歸方程為Y=2.92+ 0.36A+0.34B+0.33C+0.14AB+0.18AC-0.062BC-0.11A2-0.27B2-0.052C2（R2=0.986 9），方程因變量與自變量之間呈良好的線性關系（P＜0.01），表明該模型可以用于實際值的預測。響應面試驗設計方案及結果見表3。乙醇濃度與提取時間的交互項、乙醇濃度與料液比、提取時間與料液比的交互項對葛根素含量有顯著影響。葛根素的最優提取工藝條件是：乙醇濃度為78%，提取時間為143 min，料液比為1∶10，葛根素的最大含量預測值為4.522 mg。3批驗證試驗結果表明，葛根素平均含量為4.493%，與預測值相對誤差小于1%，表明該模型與實際情況擬合良好，模型可靠。葛根素提取交互作用的三維曲面圖見圖2。

表3 響應面試驗設計方案及結果

圖2 葛根素提取交互作用的三維曲面圖

3 討 論

在預試驗中，對提取次數、乙醇濃度、提取時間、料液比對葛根素含量的影響進行了單因素實驗。結果表明，提取2次以上明顯優于1次，而提取2次和3次沒有明顯區別，故提取次數確定為2次；乙醇濃度考察了50%、60%、70%、80%、90%，提取時間考察了30、60、90、120、150 min，料液比考察了1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12。結果表明，乙醇濃度在70%～90%、提取時間在90～150 min、料液在1∶8～1∶12內明顯變化，由此確定了響應面法的取值范圍。

近年來，響應面法逐漸應用于中藥提取工藝的優化中，其最大優點在于可在充分減少實驗次數的同時，對實驗結果進行條件的細化，而不像正交試驗那樣只能從設定的水平中選點[10-12]。本文在單因素實驗的基礎上，以葛根素含量作為指標，采用Box-Behnken原理進行響應面試驗設計，建立了乙醇加熱回流法提取葛根素的擬合方程，篩選出葛根素的最優提取工藝，并對實驗結果進行統計學分析，使提取工藝更加科學合理，為實際生產工藝的優化提供了實驗基礎。

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Study on response surface method for optimizing puerarin extraction process

Wang Ying，Wu Yanfen
（School of Pharmaceutical and Chemical Engineering，Guangdong Pharmaceutical University，Zhongshan，Guangdong 528458，China）

ObjectiveTo optimize the extraction technological parameters of Radix Puerariae in order to improve the extraction ratio of puerarin.MethodsBased on the single factor preliminary screening，with the puerarin content detected by HPLC as the response value，the three-factor and three-level Box-Behnken test design was carried on.The experimental data were analyzed by using the Design-Expert software.ResultsThe interaction action existed between the ethanol concentration and extraction time，between the extraction time and solid-liquid ratio and between the ethanol concentration and solid-liquid ratio.The optimal extraction conditions of puerarin were the ethanol concentration of 78%，the extraction time of 143 min and the solid to liquid ratio of 1∶10.ConclusionThe optimized technological extraction conditions are simple with good reproducibility and suitable for the extraction of puerarin.

Puerarin；Pharmaceutical technology；Technology；Multivariate analysis；Ethanol

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.16.007

A

1009-5519（2015）16-2426-03

2015-05-01）

王嬰（1978-），女，江西南昌人，實驗師，主要從事藥物新劑型與質量控制研究工作；E-mail：yyxm799@126.com。