多聚賴氨酸在大鼠海馬神經元原代培養中工作濃度的研究

韓璐，肖鳳，張岫美

(1.天津生物工程職業技術學院 生物技術系，天津 300461；2.河北省圍場縣醫院 消化內分泌科，河北 圍場 068450；3.山東大學醫學院 藥理學系，山東 濟南 250012)

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多聚賴氨酸在大鼠海馬神經元原代培養中工作濃度的研究

韓璐1，肖鳳2，張岫美3Δ

(1.天津生物工程職業技術學院 生物技術系，天津 300461；2.河北省圍場縣醫院 消化內分泌科，河北 圍場 068450；3.山東大學醫學院 藥理學系，山東 濟南 250012)

目的 優選多聚賴氨酸(poly-D-lysine，PDL)在大鼠海馬神經元原代培養中的最佳工作濃度。方法 頸椎脫臼處死孕18 d的Wistar大鼠3只，取出胚胎并分離腦組織。迅速分離海馬組織，胰酶消化，吹打并以合適濃度(30萬/3.5 cm皿)接種于0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 mg/mL的PDL工作濃度包被的培養皿中，采用相差顯微鏡觀察神經元形態，同時采用CCK-8試劑盒進行神經元活性檢測。結果 神經元接種4 h后貼壁，1 d后突起發生，4 d后與周圍神經元形成聯系，7 d后成熟并形成網狀聯系。PDL最佳工作濃度范圍位于0.25～0.75 mg/mL，神經元在此濃度范圍內生長狀態及活性最佳。結論 通過實驗確定了PDL最佳工作濃度，對于神經元培養有重要意義。

海馬神經元；原代培養；PDL工作濃度

海馬屬于大腦皮層邊緣系統，參與眾多高級精神活動，例如學習、記憶、情緒等。因此，海馬神經元在高級神經功能中發揮著重要的作用[1-3]。在1977年，Banker等[4]率先成功在體外分離并培養了海馬神經元，為細胞層次的神經科學研究奠定了基礎。此后，神經元培養技術得到了進一步完善及發展[5-6]。在海馬神經元分離培養過程中，步驟復雜，可變性大，關鍵步驟條件的優化對于成功培養海馬神經元至關重要。本實驗通過比對不同條件下神經元生長存活狀態，優化分離培養條件，從而為后續相關研究提供依據和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 孕18 d的雌性Wistar大鼠3只，購自北京維通利華實驗動物中心，動物合格證號：SCXK京2014-2015，許可證號：SCXK京20110011-001。本實驗遵循《實驗動物保護條例》。

1.2 主要試劑 杜氏改良培養液(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM-F12)、神經元基礎培養基(neurobasal medium)、0.05%胰酶+EDTA、B-27無血清添加劑、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自Gibco公司；多聚賴氨酸(poly-D-lysine, PDL)、青霉素/鏈霉素(penicillin and streptomycin, P/S)、L型谷氨酰胺購自sigma公司；Hank’s 平衡鹽溶液(Hank’s Balanced salt solution， HBSS) 自制：8 g/L NaCl，0.4 g/L KCl，1 g/L葡萄糖，60 mg/L KH2PO4，47.5 mg/L Na2HPO4，0.35 g/L NaHCO3，調pH至7.2。

1.3 主要儀器 解剖顯微鏡(Nikon SMZ445，尼康公司)；超凈工作臺(SCB-1360 北京東聯哈爾有限公司)；倒置相差顯微鏡(Nikon TS100，尼康公司)；CCK-8試劑盒(A311-01，Vazyme公司)；酶標儀(MK3，Thermo公司)。

1.4 方法

1.4.1 準備工作：PDL包被培養皿或者爬片：研究設計了0.01、0.05、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 mg/mL的PDL包被組，觀察最佳包被濃度。將培養皿加入PDL工作液，置于細胞培養箱中孵育40 min，回收PDL工作液，將培養皿置于超凈工作臺中晾干。晾干后用無菌的去離子水洗3次，去除為包被于皿底的PDL，然后將培養皿晾干備用。

1.4.2 神經元分離培養過程：①取材：頸椎脫臼處死孕18 d Wistar大鼠，將大鼠全身浸泡于75%消毒酒精中10～20 s。然后移至超凈工作臺，使用無菌器械剪開皮膚，更換無菌器械剪開腹肌及腹膜，暴露腹腔。連同子宮一起取出所有胎鼠至無菌的冷的HBSS中浸泡。用眼科剪取頭，用顯微解剖鑷分別剝離頭皮、顱骨、硬腦膜，暴露腦組織。用眼科鑷小心完整地取出大腦、小腦及中腦，置于無菌的冷的HBSS中。在解剖顯微鏡下放置盛有少量無菌HBSS的皿，將剝離好的腦組織置于鏡下，用顯微解剖鑷小心剝離腦組織表面的血管等結締組織，其中海馬處的結締組織可由左右向中間剝離，動作輕柔，一般可完整剝下所有結締組織。然后用維納斯剪將海馬部分小心剪下，置于冷的HBSS中。

② 消化：用維納斯剪將上一步的海馬組織剪碎，用無菌移液器移至無菌離心管中，靜置，待海馬組織下沉至管底后，小心地移除上清，加入5 mL預熱至37 ℃的0.05%的胰酶消化液。置于37 ℃水浴消化10 min，期間每隔2～3 min輕柔晃動管子，使組織懸浮起來，利于消化。10 min后，加入含有10% FBS的DMEM/F12培養基終止消化，靜置，待組織沉淀后移除上清，加入5 mL DMEM/F12(含10% BS)培養基，輕柔吹起組織，以洗去殘留的胰酶，重復洗3～4次。最后加入3～5 mL(根據組織量而定)DMEM/F12(含10% FBS)，用力吹打10～20下使消化完的組織分散為單細胞。使用200目篩網過濾后取細胞懸浮液進行稀釋。

③ 細胞計數：稀釋后的細胞進行計數，取干凈的細胞計數板，加入細胞懸浮液，靜置2 min后開始計數：將細胞計數板洗凈擦干，將細胞懸浮液滴入細胞計數板上，置于顯微鏡下靜置2 min后計數。公式如下：細胞數/L=4大格細胞數/4×稀釋倍數×107。

④ 細胞接種：預熱好神經元培養液(1%glutamate+2%B27+97%neurobasal medium)加入培養皿中，6孔板每孔接種30萬神經元。置于細胞培養箱中培養，4 h后神經元貼壁，可予以更換全部培養液，以后每3 d換1/3～1/2的培養液。

1.4.3 神經元形態觀察及檢測： ①形態觀察：用相差顯微鏡觀察不同處理組神經元生長狀態并拍照。②神經元活性檢測：用CCK-8試劑盒檢測不同時間不同處理組神經元活性，以反映神經元存活情況。

1.4.4 驗證試驗：用酶標儀檢測不同處理組神經元第8天的培養液在450 nm處的吸光度值，進行3次獨立重復試驗。

2 結果

2.1 神經元形態學觀察 倒置相差顯微鏡下觀察，接種4 h后大部分細胞已經貼壁(90%以上)，此時神經元沒有突起生長，呈圓形或略橢圓形。1 d后神經元開始長突起，約3～4 d后突起明顯增長，相鄰神經元突起相互交織，胞體增大，呈圓形或紡錘形，6～8 d逐漸成熟，胞體圓潤飽滿，光暈顯著。實驗選取第7天的神經元觀察對比不同組之間的差異，發現PDL濃度為0.1～0.5 mg/mL時神經元形態最佳，見圖1。反應神經元狀態較好，而過高濃度和過低濃度時神經元突起均僵硬、變直且飄起、未貼壁，胞體出現類似凋亡小泡的空泡結構。繼續觀察至10 d后此組神經元大部分死亡。

圖1 第7天不同處理組神經元形態(×200)Fig.1 Morphology of neurons in different groups in day 7(×200)

2.2 神經元存活活力檢測 用CCK-8試劑盒檢測神經元活力狀態，活力與吸光度成正比，可以反映存活情況。見圖2，結果表明：0.01～2 mg/mL各組450 nm的吸光度OD值平均值分別為0.15896、0.2568、0.32158、0.4122、0.41369、0.3658、0.20235、0.10235，PDL在(0.01～0.5 mg/mL)工作濃度范圍內，海馬神經元存活隨PDL濃度升高而增強，且高于一定范圍即產生明顯的毒性作用。

圖2 不同處理組吸光度值(n=3)Fig.2 Absorbance value of different treatment groups(n=3)

2.3 驗證試驗結果 圖1和圖2均經過3次獨立重復試驗。由于神經元為高度分化的細胞，不會增殖，因此CCK-8吸光度反映存活神經元數。由圖2可以看出在0.25～0.75 mg/mL的PDL濃度時，神經元形態最佳且活力最高，提示神經元在0.25～0.75 mg/mL的PDL工作濃度時有最佳的存活狀態。

3 討論

神經元培養技術對于神經生物學的科學研究非常重要，特別是在細胞水平上進行相關疾病的發生、發展、轉化等研究中，能夠提供穩定的、易于重復的，同時又便于實驗控制及干預的模型[5],例如研究馬達蛋白在神經元中的作用過程中，需要體外培養神經元[6], 在某些疾病模型中，體外神經元培養也是重要的研究方法，例如腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)先天性基因突變導致其不能調節型分泌[7]。因此，神經元體外培養對于神經科學工作人員來說是必備的基本的技能。

神經元的體外培養技術的基本過程在國內外已經基本成熟[8-10]。由于取材過程中不可能完全分離膠質細胞與神經元，同時由于操作誤差也容易污染成纖維細胞。膠質細胞及成纖維細胞在血清的刺激下均有顯著的增殖，時間久了以后在培養過程中會明顯妨礙神經元的觀察及實驗。因此采用血清替代物B27來提供神經元生長必需的營養物質，同時對于膠質細胞和成纖維細胞的生長有顯著的抑制作用。總的來說，神經元在無血清培養基中生長情況良好，目前與在含有血清的培養環境中相比，生長狀態無異。

神經元是高度分化的細胞，沒有分裂增殖，只能原代貼壁培養，因此其接種后的貼壁對于其存活來說至關重要。由于腦組織特殊的結構，神經元“天生”不具有較好的貼壁能力，因此需要事先于培養皿表面包被一層PDL以改變皿上的電荷，使細胞更易于結合貼附[11]。但是PDL對于細胞具有一定的毒性作用，因此其皿中剩余的PDL量對于神經元的存活就尤為重要。在實驗過程中發現PDL的包被效果對于神經元的存活有重大影響，37 ℃包被40 min時，在0.25～0.75 mg/mL的工作濃度下神經元存活最好，過高或者過低均對神經元形態及活性有顯著抑制作用。因此實驗建議PDL包被條件為：0.25～0.75 mg/mL于37 ℃孵育40 min后，吸出PDL，晾干培養皿后用去離子水洗3遍后晾干備用。

神經元取材過程中其他的關鍵步驟：①剝離結締組織膜的時候一定要剝離徹底，否則極易污染成纖維細胞；②盡量不要使用阿糖胞苷等分裂抑制劑，避免其對神經元產生損傷作用，阿糖胞苷會極大影響神經元的狀態；③胰酶消化的時間需要把握好，一般在10 min左右較好。時間過短會消化不充分，導致后續的吹打過程劇烈從而損傷細胞，消化時間過長會導致細胞損傷，同樣減少神經元得量；④神經元換半液對于神經元狀態有重要作用，神經元自身會分泌神經營養因子類物質，如：BDNF、神經生長因子(nerve growth factor，NGF)等。從而促進神經元的存活、生長等進程[12]，換半液有助于保留神經營養因子等營養物質；⑤吹打細胞時要輕柔，盡量減少物理損傷；⑥離心對細胞也是一種損傷，所以應盡量減少離心時間及離心次數。

綜上所述，PDL工作濃度及工作時間對于神經元的存活至關重要。神經元體外培養過程中各個細節均需要注意。本實驗中篩選的PDL工作濃度下神經元生長良好，存活多。其他列舉的注意事項對于優化神經元體外培養技術均有很大幫助。

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(編校：王冬梅)

Study on working concentration of PDL in primary culture of rat hippocampal neuron

HAN Lu1, XIAO Feng2, ZHANG Xiu-mei3Δ

(1.Department of Biotechnology, Tianjin Vocational College of Bioengineering, Tianjin 300461, China; 2.Department of Gastroenterology and Endocrinology, Hebei Weichang County Hospital, Weichang 068450, China; 3.Department of Pharmacology, School of Medicine, Shandong University, Ji’nan 250012, China)

ObjectiveTo explore working of concentration of PDL used in primary culture of rat hippocampal neurons.Methods3 pregnant wistar rats were executed by cervical dislocation, the embryos were taken out and the hippocampal tissue was dissected quickly.Then the tissue was digested by trypsin and planted into dishes with proper concentration(300000/3.5cm vessle)which were coated by different PDL solution in different concentration (0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,0.75,1,2 mg/mL).The state of the cultured neurons was observed to determine the most suitable concentration of PDL solution in coating dishes.Neurons activity was observed by CCK-8 Kit.ResultsMost neurons had adhered in 4 h.Protrusion of neurons began to grow in 1 d.The connection between neurons appeared in 4 d.Neurons matured and the network-connection was set up in 7 d.The best working concentration of PDL is between 0.25 and 0.75 mg/mL, neurons grew well and activity was optimum during this concentration.ConclusionThe working concentration of PDL is important for the hippocampal neuron culture and this work is worth being applied.

hippocampal neurons; primary culture;working concentration of PDL

韓璐，女，碩士，講師，研究方向：細胞生物學，E-mail：luhan2010@126.com；張岫美，通訊作者，男，博士，教授，研究方向：中樞神經損傷與修復的藥物干預及細胞分子機制，E-mail：zhangxm@sdu.edu.cn 。

R331

A

1005-1678(2015)05-0037-03