miR-18a和雌激素受體α在單發及多發子宮肌瘤中的表達

廖治，肖洪濤

(1.電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院 婦產科，四川 成都 610072；2.電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院 藥學部，四川 成都 610072)

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miR-18a和雌激素受體α在單發及多發子宮肌瘤中的表達

廖治1，肖洪濤2

(1.電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院 婦產科，四川 成都 610072；2.電子科技大學附屬醫院·四川省人民醫院 藥學部，四川 成都 610072)

目的 檢測單發及多發子宮肌瘤組織中miR-18a及雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)的表達，探討miR-18a與ERα的關系及2者在單發及多發子宮肌瘤發生中的作用。方法 采用原位雜交法檢測miR-18a在單發及多發子宮肌瘤組織石蠟切片中的表達；采用免疫組化法檢測ERα在單發及多發子宮肌瘤組織石蠟切片的表達。采用相關分析研究miR-18a和ERα的表達相關性。結果 多發子宮肌瘤組織中的ERα表達水平均明顯高于單發子宮肌瘤組織(P<0.05)；但miR-18a水平明顯低于單發子宮肌瘤組織(P<0.05)；相關分析結果表明，2者表達呈負相關(r單發=-0.4421，r多發=-0.4181)。結論 多發性子宮肌瘤中miR-18a的表達更低，ERα表達更高。miR-18a可作為治療多發性子宮肌瘤的新靶標。

miR-18a；雌激素受體α；多發子宮肌瘤；單發子宮肌瘤

子宮肌瘤是婦科常見良性腫瘤，其發病率呈逐年上升趨勢，但其病因、發病機制至今尚未完全明了。目前認為子宮肌瘤是一種激素依賴性良性腫瘤，在子宮肌瘤生長過程中，雌激素、孕激素的細胞作用主要為誘導轉錄、合成調節、分化蛋白質，而這一作用是雌、孕激素通過作用于靶器官內的雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptors，PR)產生的。人的ER有2種亞型即ERα和ERβ，ERα作為雌激素受體之一對子宮肌瘤的發生發展起到關鍵作用。臨床上常見的肌瘤以多發性子宮肌瘤為主，但也有一部分單發性子宮肌瘤。以往分子生物學研究結果提示[1-3]，單發性子宮肌瘤是由單克隆平滑肌細胞增殖而成；多發子宮肌瘤是由不同克隆細胞形成；但是在分子及體液機制下是否有其他的調控異常，目前尚不明確。

microRNA(miRNA)是一種廣泛存在于真核生物細胞中的非編碼單鏈小分子RNA，參與多種腫瘤的發生、發展及轉移過程[4]，并與腫瘤的預后密切相關，是腫瘤早期診斷及判斷預后的良好指標[5-6]。miR-18a的表達異常在肝細胞癌、結腸癌、妊娠期高血壓疾病等多種疾病中得到證實。研究發現在疾病發生發展過程中miR-18a與ERα之間有靶向調節關系[7-9]。

本課題組之前的研究表明[10]，ERα可能是miR-18a的靶基因之一，ERα在子宮肌瘤中的高表達是由于miR-18a的下調引起的。miR-18a和ERα與子宮肌瘤發病具有一定的相關性。為進一步了解miR-18a和ERα在單發及多發子宮肌瘤中的表達差異，以探索可能的作用機制，本文旨在檢測miR-18a和ERα在單發及多發中的表達，探討2者相關性，為治療子宮肌瘤提供新的依據和線索。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選擇四川省人民醫院2014年1月～2014年7月因子宮肌瘤入院行子宮全切或肌瘤挖除術的患者60例，其中單發性子宮肌瘤30例，多發性子宮肌瘤(≧2個)30例，患者平均年齡(40.2±4.5)歲；取樣的子宮肌瘤直徑均>5 cm，取其切除的肌瘤組織的病理存檔蠟塊。入選患者術前3個月內未服用任何激素類藥物，未合并其他疾病，術后病理診斷均為子宮平滑肌瘤。

1.2 主要實驗試劑 Has-miR-18a miRCURY LNA Detection probe、地高辛(DIG)標記LNA-miR-18a均購自Exiqon公司；兔抗人ERα(Millipore)、羊抗兔Ⅱ抗(Abcam)購自Abcam公司；SP免疫組化染色試劑盒、DAB酶底物顯色試劑盒、抗原修復液均購自成都正能生物技術有限公司；無水乙醇、多聚甲醛、蘇木素為國產分析純。

1.3 方法 全部標本均為10%福爾馬林固定、石蠟包埋的子宮肌瘤組織標本，切片厚4 μm。

1.3.1 原位雜交檢測miR-18a的表達：取石蠟包埋組織去石蠟、水化、檸檬酸鹽抗原修復，49.5 ℃，雜交緩沖液中預雜交2 h，加入DIG labeled miRCURYTMprobes過夜。加入HRP標記的抗地高辛抗體(1:200)，4 ℃孵育過夜。TBST沖洗，在暗室中加染色溶液，孵育24 h。當達到期望的亮度時，將載玻片移至終止液(1 mM EDTA-PBS溶液)終止反應，蘇木素復染。

1.3.2 免疫組織化學法檢測ERα的表達：石蠟組織塊脫蠟、水化后，微波處理使抗原激活。按照抗體說明書要求加入抗體，二氨基聯苯胺(DAB)顯色。陽性結果呈棕黃色。

1.4 結果判定標準 原位雜交及免疫組織化學結果應用Image-Pro Plus(IPP )軟件進行分析，測量平均光密度(即時IOD/area)；根據胞漿陽性細胞數以及染棕黃色及黃色數的多少來劃分等級，染色分布彌散且陽性細胞>50%為強陽性(+++)，陽性細胞為25%～50%為陽性(++)，陽性細胞10%～25%為弱陽性(+)，陽性細胞<5%或不染色為陰性(-)。

2 結果

2.1 miR-18a在單發及多發子宮肌瘤平滑肌細胞中的表達 原位雜交結果顯示，miR-18a在單發及多發子宮肌瘤平滑肌細胞中均有表達，miR-18a陽性表達定位于細胞核內，為棕黃色染色，見圖1。多發子宮肌瘤肌細胞中miR-18a平均光密度為82.38±4.26，顯著低于其在單發子宮肌瘤肌細胞中的表達，為95.11±3.56，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1 miR-18a在多發子宮肌瘤(A)和單發子宮肌瘤(B)中的表達(×200)Fig.1 Expression of miR-18a in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.2 ERα在單發及多發子宮肌瘤平滑肌細胞中的表達 ERα在單發及多發子宮肌瘤平滑肌細胞中均有表達，ERα陽性表達定位于細胞核內，為棕黃色染色，見圖2。多發子宮肌瘤肌細胞中ERα表達水平的平均光密度值為354.47±18.57，顯著高于其在單發子宮肌瘤肌細胞中的平均光密度值322.15±24.1，比較差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 ERα在多發子宮肌瘤(A)和單發子宮肌瘤(B)中的表達(×200)Fig.2 Expression of ERα in multiple uterine fibroids(A) and single uterine fibroids(B) (×200)

2.3 子宮肌瘤中miR-18a表達與ERα表達的相關性 miR-18a與ERα在單發及多發子宮肌瘤中的表達均呈負相關(r=-0.4211，P<0.05；r=-0.4181，P<0.05)。見表1、表2。

表1 miR-18a與ERα在單發子宮肌瘤中的計數表達(n=30)Tab.1 miR-18a and ER alpha count in single uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

表2 miR-18a與 ERα在多發子宮肌瘤中的計數表達(n=30)Tab.2 miR-18a and ER alpha count in multiple uterine fibroids(n=30)

*P<0.05

3 討論

子宮平滑肌瘤是雌激素依賴性疾病，已有研究證實肌瘤組織中ER、mRNA表達成倍增加，雌激素通過其受體ERα和ERβ發揮生物學效應，子宮肌瘤的發生與患者局部內分泌環境異常有關，在女性子宮中以ERα為主[11]，盡管外周血中雌激素水平相似，但是局部組織受體密度可能決定其最終效應。ERα作為雌激素受體之一對子宮平滑肌瘤的發生、發展起到關鍵作用。

miRNA廣泛參與了人類及各種生物的生理病理過程，腫瘤的發生中miRNA也起著重要的作用。有關子宮肌瘤發生中miRNA的報道最早見于2007年，一個miRNA可以調節多個靶基因的表達，幾種miRNA也可以共同調控一個靶基因的表達。miRNA主要通過與靶mRNA的3′-非翻譯區(3′-UTR)互補配對而負調控基因表達，當miRNA和目的mRNA完全互補時，降解目的mRNA；當不完全互補時，則負向調控翻譯過程，阻礙蛋白質翻譯[12-13]。在子癇前期孕婦胎盤組織中發現miR-18a的病理性低表達[14-16]，并且初步預測出其靶基因是ERα。但在子宮肌瘤中這2者的相關性研究仍然較少。本課題組之前的研究發現，miR-18a在子宮肌瘤中表達下降，ERα則在肌瘤組織中高表達。且在同一位患者樣本中，miR-18a在子宮肌瘤組織中低表達，而ERα在肌瘤組織中高表達，表明2者之間存在負向調節。這種負向調節暗示ERα可能是miR-18a的靶基因之一，即ERα在子宮肌瘤中的高表達是由于miR-18a表達下調引起的。因此miR-18a和ERα與子宮肌瘤發病存在一定的聯系。

本研究分單發及多發子宮肌瘤2組，且肌瘤直徑均在5 cm以上，結論提示多發子宮肌瘤的ERα表達水平均明顯高于單發子宮肌瘤，但miR-18a水平則比單發子宮肌瘤組織中的表達弱；同一肌瘤組織中這2者表達呈負相關。說明多發性子宮肌瘤中miR-18a的缺失更明顯，可能導致多發肌瘤中ERα表達水平進一步增加。ERα的增多放大了雌激素的作用，肌瘤局部的“高雌激素受體環境”加速了靶細胞分裂、增殖，可能啟動了子宮肌瘤的發生且同時導致肌瘤多發；而其上游調控基因miR-18a通過影響ERα表達參與子宮肌瘤的發生發展過程。

本研究結果表明miR-18a可能成為治療子宮肌瘤的新靶標，為揭示其發病分子機制和治療子宮肌瘤提供了新線索。但miRNAs作為基因調控機制中一個新成員，其具體調控機制還有待進一步研究，這將是下一步研究的方向。

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(編校：吳茜)

MiR-18a and estrogen receptor alpha expression in single and multiple uterine fibroids

LIAO Zhi1, XIAO Hong-tao2

(1 Department of Gynecology and Obstetrics, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China;2.Department of Pharmacy, Hospital of the University of Electronic Science and Technology of China, Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, China)

ObjectiveTo detect the expression of miR-18a and estrogen receptor alpha (ER alpha) in single and multiple uterine flesh tumor tissues, discuss the relationship between miR-18a and ER alpha, and their effect in single and multiple uterine fibroids.MethodsThe expression of miR-18a and ER alpha in single and multiple uterine fibroids tissue paraffin section were detected by in situ hybridization method and immunohistochemical method, respectively.And the correlation between the miR-18a and ER alpha were evaluated.ResultsThe expression of ER alpha in multiple uterine fibroids group was significantly higher than that of single uterine fibroids tissues (P<0.05); while miR-18a was weaker than that of single uterine fibroids tissues(P<0.05).The correlation results showed that miR-18a expression was correlated negatively with ER alpha expression either in single(r=-0.4421) and multiple uterine fibroids(r=-0.4181).ConclusionThe expression of miR-18a is low in multiple uterine fibroids, while ER alpha had high expression.miR-18a could bea new target for the treatment of multiple uterine fibroids.

miR-18a; estrogen receptor alpha.multiple uterine fibroids; single uterine fibroids

四川省衛生廳項目(100491，120111)，四川省人民醫院青年基金(30305030606，30305030859)；四川省科技廳項目(2014FZ0103，2015JQO027，2015ZR0160)

廖治，女，碩士，副主任醫師，研究方向：婦產科，E-mail：liaozhi130@163.com；肖洪濤，通訊作者，男，博士，副主任藥師、副研究員，研究方向：臨床藥理學，E-mail：xht927@163.com。

R737

A

1005-1678(2015)09-0054-03