神經節苷脂GM1對大鼠急性腦損傷的保護作用及相關機制研究

張波，戚利坤，李立新

(1.青海省人民醫院 神經內科，青海 西寧 810007；2.青海省第五人民醫院 神經內科，青海 西寧 810007；3.南京醫科大學，江蘇 南京 210029)

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神經節苷脂GM1對大鼠急性腦損傷的保護作用及相關機制研究

張波1Δ，戚利坤2，李立新3

(1.青海省人民醫院 神經內科，青海 西寧 810007；2.青海省第五人民醫院 神經內科，青海 西寧 810007；3.南京醫科大學，江蘇 南京 210029)

目的 探究單唾液酸四己糖神經節苷脂(monosialoganglioside，GM1)對大鼠急性腦損傷的保護作用及相關機制。方法 采用落體撞擊法使大鼠左頂葉形成局部性腦挫裂傷。將65只SD大鼠隨機分為假手術組(n=5)、腦損傷組(n=30)和GM1組(n=30)，分別在造模給藥后3、7、14、28、56、168 h時，每次各組隨機選取5只(假手術組為1只)，通過免疫組化染色檢測腦組織Bcl-2、Bax的蛋白表達以及PARP降解情況，TUNEL法觀察神經細胞凋亡的情況。 結果 腦損傷組各時間點Bax、Bcl-2蛋白表達與假手術組比較差異有統計學意義(P<0.05)，GM1組各時間點Bax、Bcl-2蛋白表達與腦損傷組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且GM1組在14 h后Bax、Bcl-2蛋白表達與假手術組差異無統計學意義。給藥后Bax/Bcl-2比值有所下降，在14 h下降最為明顯。腦損傷組PARP降解及細胞凋亡率在各時間點顯著高于假手術組(P<0.05)，GM1組PARP降解在28、56、168 h顯著低于腦損傷組(P<0.05)，神經細胞凋亡率在各時間點顯著低于腦損傷組(P<0.05)。結論 神經節苷脂GM1能夠降低急性腦損傷大鼠Bax/Bcl-2比值，同時PARP降解緩解，凋亡細胞減少。

單唾液酸四己糖神經節苷脂;急性腦損傷;細胞凋亡

單唾液酸四己糖神經節苷脂(monosialoganglioside，GM1)主要分布于腦內，GM1是神經系統發育不可缺少的因子，且對神經系統的發育起著保護作用。近來的研究發現[1]，缺血再灌注形成腦損傷時，腦組織內源性GM1含量下降，是腦損傷后神經元損傷、功能損害的重要原因。內源性GM1可能是通過參與調節細胞凋亡相關蛋白Bal-2、Bax的含量控制細胞凋亡，從而達到保護腦損傷的作用[2-3]。目前研究證實，外源性GM1能夠通過血腦屏障，對神經元的凋亡起著一定的抑制作用,同時促進腦損傷后神經元的修復[4]，但是對于GM1在急性腦損傷中修復的作用和機制尚不清楚。本實驗通過構建大鼠急性腦損傷模型，探究外源性GM1對大鼠急性腦損傷修復的影響以及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：65只雄性SPF級Sprague-Dawley大鼠購自南華大學實驗動物學部，動物許可證號：SCXK(湘)2010-0004，體質量250～300 g，2月齡，給予正常飼料喂養。本研究遵循《實驗動物保護條例》。

1.1.2 試劑與儀器：Bax、Bcl-2單克隆抗體購自Cell Signaling公司；TUNEL試劑盒購自羅氏(Roche)公司；Anti-PARP p85 Fragment pAb試劑盒購自Promega公司。HMIAS-2000高清晰彩色醫學圖文分析系統購自武漢千屏影像技術有限責任公司；OCT冰凍切片包埋劑購自上?；鶆ι锟萍加邢薰尽?/p>

1.2 方法

1.2.1 動物分組及急性腦損傷大鼠模型的建立：SD大鼠65只，隨機分為假手術組(n=5)、腦損傷組(n=30)、GM1組(n=30)(腦損傷10 min后腹腔注射GM1，50mg/kg)。

腦損傷的模型建立采用Feeney等[5]的落體沖撞法以致左頂葉局部性腦挫裂傷，形成挫傷沖擊力大小為500g/cm。2組大鼠分別于造模后3、7、14、28、56、168 h時，每次各隨機選取5只(假手術組為1只)處死，將假手術組大鼠各時點相關指標表達情況合并統計，處死后均取損傷左頂葉與對側腦組織，用4%的多聚甲醛固定后，OCT冰凍切片包埋劑包埋，常規切片5～6μm，用于免疫組化檢測。

1.2.2 實驗動物模型評價系統：評價急性腦損傷模型采用Feeney等[5]評定方法，共4級：0級，神經功能無損傷；1級，提尾見大鼠癱瘓側前肢回收彎曲，正常側往前展開；2級，1級表征外，觸碰大鼠癱瘓側遇阻力低于正常側；3級，2級表征外，大鼠爬動時往癱瘓側旋轉；模型建立后2 h開展評分，若大鼠評為0級則選入假手術組。評價為1、2、3級則模型建立成功，為腦損傷組。

1.2.3 免疫組化法檢測Bcl-2、Bax蛋白：按Bcl-2、Bax單克隆抗體試劑盒說明書對切片進行染色，在顯微鏡下分別觀察各組不同時間點的損傷局部與同側部位。Bax和Bcl-2陽性細胞的細胞漿以及核膜判定為棕黃色顆粒狀物質。染色結果利用HMIAS-2000高清晰彩色醫學圖文分析軟件分析，每例切片各選取5個視野，測定陽性細胞灰度值，以及背景灰度值，計算相對灰度值(相對灰度值=背景灰度值-陽性灰度值)及平均相對灰度值， 相對灰度值越高， 表明蛋白表達越強。Bax/Bcl-2比值

越大凋亡率越高。

1.2.4 TUNEL染色檢測腦損傷PARP降解：采用Anti-PARP p85 Fragment pAb和原位末端轉移酶標記技術(TUNEL)分別檢測各組大鼠不同時間點損傷局部與對側部位的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)降解情況及細胞凋亡情況，參照試劑盒說明書操作，凡能在細胞核內觀測到棕黃色顆粒的為TUNEL染色陽性細胞。

2 結果

2.1 模型評價 建立急性腦損傷模型2 h后進行模型評價，假手術組大鼠腦損傷評價6只均為0；腦損傷組1級11只，2級12只，3級7只；GM1組1級12只，2級12只，3級6只。

2.2 免疫組化檢測Bcl-2與Bax蛋白的表達 Bcl-2與Bax蛋白免疫組化染色結果見圖1。Bcl-2蛋白的表達在GM1腹腔注射后14 h時達到最大值，隨后降低，而Bax蛋白的表達在腹腔注射后28 h達到最低。腦損傷組各時間點Bax、Bcl-2蛋白表達與假手術組比較差異有統計學意義(P<0.05)，GM1組Bax、Bcl-2蛋白表達顯著與腦損傷組比較差異有統計學意義(P<0.05)，且GM1組在14 h后Bax、Bcl-2蛋白表達與假手術組差異無統計學意義。給藥后Bax/Bcl-2比值有所下降，在14 h下降最為明顯。見表1。

圖1 免疫組化檢測GM1組中Bax與Bcl-2蛋白表達(×200)Fig.1 Expression of Bax and Bcl-2 protein in GM1 group detected by immunohistochemistry(×200)

組別檢測指標3h7h14h28h56h168h假手術組(n=6)BaxBcl-2Bax/Bcl-285.24±2.4189.00±6.800.93腦損傷組(n=5)Bax103.77±6.89*104.53±2.26*106.00±3.19*107.98±4.23*108.32±1.70*119.99±2.33*Bcl-2102.72±5.92*110.77±3.40*120.99±2.86*96.32±4.42*100.55±4.00*95.86±1.70*Bax/Bcl-21.011.071.001.101.071.22GM1組(n=5)Bax92.53±2.41*#93.39±1.11*#94.00±2.44#95.95±4.49#86.23±1.76#85.12±2.58#Bcl-2102.07±3.30*89.11±3.46#88.66±3.42#86.55±3.72#90.66±1.11#87.45±4.22#Bax/Bcl-20.900.850.720.880.940.96

*P<0.05,與假手術組比較，compared with sham-operation；#P<0.05，與腦損傷組比較，compared with brain injury group

2.3 TUNEL染色與腦急性損傷PARP降解測定 腦損傷組PARP降解及細胞凋亡率在各時間點顯著高于假手術組(P<0.05)，GM1組PARP降解在28、56、168 h顯著低于腦損傷組(P<0.05)，細胞凋亡率在各時間點顯著低于腦損傷組(P<0.05)，其中PARP降解在14 h后開始減緩。見表2。

表2 各組大鼠急性腦損傷后不同時間點PARP降解與細胞凋亡的變化±s，%)Tab.2 Changes of PARP degradation and neuronal apoptosis at different time points after traumatic brain injury in each ±s，%)

*P<0.05,與假手術組比較，compared with sham-operation；#P<0.05，與腦損傷組比較，compared with brain injury group

3 討論

單唾液酸四己糖神經節苷脂(GM1)具有介導細胞與細胞、細胞與基質間的相互作用，可以調控細胞膜中蛋白質的功能。Bcl-2和Bax 2者形成了凋亡的正負控制，其比值決定了細胞是否出現凋亡。實驗從急性腦損傷大鼠的腦皮質免疫組化觀察到損傷的不同時間下GM1對Bcl-2,Bax蛋白表達及PARP降解的變化。GM1能夠通過血腦屏障與GM1受體結合，作用至神經元，從而加速蛋白的合成，起到促進神經系統發育，防止損傷的神經元凋亡的作用,可能與GM1的量有關。急性腦損傷中已經發現有GM1含量的下降以及神經元的損傷，補充GM1在一定程度上可以抑制損傷造成的細胞凋亡[6-7]。Bax蛋白有對抗Bcl-2蛋白抑制而細胞凋亡的作用，Bcl-2蛋白抑制細胞凋亡必須通過與Bax形成異源二聚體來實現，2者復雜的反應與調控，產生細胞存亡的不同結果。

本研究免疫組化的結果顯示，腦損傷組的大鼠Bcl-2的蛋白表達明顯下降，而Bax的表達明顯升高，與很多研究報道的結論一致[8-9]，Bcl-2和Bax與腦損傷細胞凋亡密切相關，可能是由于線粒體氧代謝的改變，細胞氧化應激等原因[10-11]。本實驗結果顯示腹腔注射外源性GM1可以顯著地降低Bax蛋白的含量，增加Bcl-2的含量，可能與外源性GM1通過調控線粒體通路蛋白含量，抑制神經元凋亡發揮作用。本研究還發現，腹腔注射GM1后，Bax/Bcl-2的比值在14 h時達到最低值，且此時PARP降解的測定與TUNEL染色均顯示凋亡細胞的數目減少，提示GM1腹腔注射14 h后效果最好。因此，外源性GM1不僅對急性腦損傷后神經元的凋亡有抑制作用，而且在14 h藥物效果較好。

本研究探究了GM1 在急性腦損傷的作用及相關機制，結果證實GM1能夠通過Bax，Bcl 2蛋白抑制神經細胞凋亡，促進腦損傷組織修復。但外源性GM1調節Bax/Bcl-2的含量的具體機制，以及外源性GM1的藥效學特征、藥物代謝動力學特征對其神經保護作用的影響，仍需要進一步基礎研究支持，從而為臨床上治療急性腦損傷提供有利的保證。

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(編校：王儼儼)

Protective effect of ganlioside GM1 on rats with acute brain trauma and its relevant mechanism

ZHANG Bo1Δ, QI Li-kun2,LI Li-xin3

(1. Department of Neurology, Qinghai Provincial People’s Hospital, Xining 810007, China; 2. Department of Neurology, Fifth People’s Hospital of Qinghai Province, Xining 810007, China; 3. Nanjing Medical University, Nanjing 210029, China)

ObjectiveTo explore the protective effect of monosialoganglioside (GM1) on rats with acute brain trauma and its relevant mechanism. MethodsLocalized brain contusion model in rats were constructed by Feeney’s method. 65 SD rats were randomly divided into three groups: sham-operation group (n=5), brain injury group (n=30) and GM1 group (n=30). The rats were killed at 3, 7, 14, 28, 56, 168 h after administration, 5 rats in each group (1 rats in sham-operation group). Bax and Bcl-2 protein expression and PARP were decected by immunohistochemical method. The neuronal apotosis was detected by TUNEL. ResultsThere were significant differences in expression of Bax and Bcl-2 protein between brain injury group and sham-operation group at each time point (P<0.05). There were significant differences in expression of Bax and Bcl-2 protein between GM1 group and brain injury group at each time point (P<0.05), while there were no significant differences in expression of Bax and Bcl-2 protein after 14 h between GM1 group and sham-operation group. After administration, the Bax/Bcl-2 values decreased and was obvious at 14 h. Degradation of PARP and rate of neuronal apotosis in brain injury group at each time point were significantly higher than those in sham-operation group (P<0.05). Degradation of PARP in GM1 group at 28 h, 56 h, 168 h were significant lower than those in brain injury group (P<0.05), and rate of neuronal apotosis was lower at each time point than those in brain injury group (P<0.05). ConclusionGM1 could reduce value of Bax/Bcl-2, degradation of PARP and apoptosis in rats with traumatic injury brain.

monosialoganglioside; acute brain trauma; apoptosis

國家自然科學基金(81171147)

張波，通訊作者，女，本科，主治醫師，研究方向：神經內科常見病、多發病及神經重癥醫學，E-mail: qch1821460057@163.com。

R96

A

1005-1678(2015)09-0048-03