HPLC法測患者血清萬古霉素和去甲萬古霉素濃度

劉斌，童彤

(安徽省立醫院 藥劑科，安徽 合肥 230001)

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HPLC法測患者血清萬古霉素和去甲萬古霉素濃度

劉斌Δ，童彤

(安徽省立醫院 藥劑科，安徽 合肥 230001)

目的 建立高效液相色譜法同時檢測人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素濃度。方法 色譜柱為Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液(9.5:2.5:88)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為280 nm，柱溫為35 ℃，萬古霉素和去甲萬古霉素互為內標物質。結果 萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度在1.25～100 μg/mL內線性關系良好，R2=0.9996；萬古霉素低、中、高濃度的平均方法回收率分別為96.88%、99.50%、105.01%；去甲萬古霉素低、中、高濃度的平均方法回收率分別為94.40%、103.90%、103.81%；日內、日間精密度RSD均<5%。結論 該方法靈敏度高、簡單、采血量少且成本低，適于萬古霉素及去甲萬古霉素血藥濃度監測和臨床藥代動力學研究。

高效液相色譜法；萬古霉素；去甲萬古霉素；人血清；血藥濃度

萬古霉素(Vancomycin)屬于糖肽類大分子抗生素，由于萬古霉素的藥力較強，一般在其他抗生素對病菌無效時被使用。主要用于敏感革蘭氏陽性菌所致的系統感染和腸道感染，如心內膜炎、敗血癥、偽膜性腸炎、骨髓炎、肺炎等感染性疾病等[1]。去甲萬古霉素(Norvancomycin)的化學結構、藥理性質和抗菌作用均與萬古霉素相似，是我國自主研制開發的萬古霉素同類產品，活性稍強于萬古霉素。2者均屬快效殺菌劑，通過作用于細菌細胞壁，抑制細菌細胞壁的合成[2]。2者口服均不吸收,隨著用藥劑量或滴注速度的增加血藥濃度會不斷的延長,繼而產生耳毒性和腎毒性[3]等一系列不良反應[4]。因此，臨床上在使用該藥物的同時，要密切觀察患者的血藥濃度，調整藥物劑量，即對患者血藥濃度進行監測，以減少不良反應的發生。國內外均有報道該藥物治療藥物監測的方法，檢測方法有主要高效液相色譜法(HPLC)、微生物檢測法、熒光偏振免疫法(FPIA)等[5-10]。由于微生物檢測法耗時較長，且其精密度較低，目前在臨床上主要使用FPIA法測定，其操作簡單易行，相對與微生物檢測法來說精密度較高。但是又有國外文獻報道[11-12]，熒光偏振免疫法與高效液相色譜法相比，測定值容易偏高。Morishige 等[12]曾對FPIA標準血樣穩定性進行研究，表明其穩定性較差。HPLC相對于FPIA法，其檢測限和精密度較低，分析過程簡單，費用較低，患者更易于接受。所以，建立快速、準確的HPLC法，供臨床進行萬古霉素和去甲萬古霉素血藥濃度的監測及藥動學研究，是很有必要的。本實驗欲通過建立HPLC法同時測定人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素的血藥濃度的方法，以期探索方便、易行、省時且靈敏度高的檢測方法可供臨床使用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Waters高效液相色譜儀(包括515四元泵、2487紫外檢測器、手動進樣器、TC-100柱溫箱、HS色譜工作站V400+)(美國Waters公司)；BT25S電子天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；XW-80A微型漩渦混合儀(上海滬西分析儀器廠)；pHS-2C型酸度計(上海雷磁儀器廠)。

1.1.2 藥品與試劑：萬古霉素標準品(中國藥品生物制品檢驗所，批號：140328-200601，純度95.5%)；去甲萬古霉素標準品(中國藥品生物制品檢驗所，批號：140313-200603，純度83.4%)。乙腈(色譜純，天津市福晨化學儀器廠)；甲醇(色譜純，天津市大茂化學試劑廠)；磷酸二氫鉀(分析純，無錫市展望化工試劑有限公司5)；磷酸、高氯酸均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱為Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為pH=3.6的甲醇-乙腈磷酸-二氫鉀緩沖液(9.5:2.5:88)；流速為1.0 mL/min；檢測波長為280 nm(參照2010年版《中國藥典》)；柱溫為35 ℃。

1.2.2 流動相的配制：稱取磷酸二氫鉀6.805 g，用蒸餾水溶解后定容至1000 mL,用磷酸調節pH值至3.6，即得0.05 mol/L的磷酸二氫鉀緩沖溶液。

1.2.3 沉淀劑的配制：將乙腈-6%高氯酸按1︰6的比例混合即得。

1.2.4 標準儲備液的配制：精密稱取20.9424 mg萬古霉素標準品(純度為95.5%)于10 mL容量瓶中，以蒸餾水溶解后定容，搖勻，即得濃度為2000 μg/mL的萬古霉素儲備液，置于4 ℃冰箱保存，臨用時用蒸餾水稀釋成濃度分別為12.5、25、50、100、250、500、1000 μg/mL的標準液。稱取11.9904 mg去甲萬古霉素標準品(純度83.4%)于10 mL容量瓶中，以蒸餾水定容，搖勻，即得濃度為1000 μg/mL的去甲萬古霉素儲備液，置冰箱4 ℃保存，臨用時用蒸餾水稀釋成濃度分別為12.5、25、50、100、250、500、1000 μg/mL的標準液。

1.2.5 血清樣品預處理：取待測樣品200 μL于1.5 mL EP 管中, 加入上述沉淀劑200 μL漩渦震蕩2 min,15000 r/min,離心15 min，取上清液20 μL進樣。

1.2.6 標準曲線

① 萬古霉素標準曲線：精密移取180 μL空白血清至1.5 mL EP管中,加入100 μg/mL去甲萬古霉素，萬古霉素標準液各20 μL，使萬古霉素血清終濃度分別1.25、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL，按1.2.1項下進行處理。計算萬古霉素與去甲萬古霉素的峰高比，以血清濃度(X)與峰高比值(Y)進行線性回歸分析。

② 去甲萬古霉素標準曲線：精密移取180 μL空白血清,100 μg/mL萬古霉素，去甲萬古霉素標準液各加入20 μL，使去甲萬古霉素血清終濃度別1.25、2.5、5、10、25、50、100 μg/mL，按1.2.3項下進行處理。計算去甲萬古霉素與萬古霉素的峰高比，以血清濃度(X)與峰高比值(Y)進行線性回歸分析。

③ 精密度實驗：精密移取180 μL空白血清,萬古霉素、去甲萬古霉素標準液各加入20 μL，使萬古霉素、去甲萬古霉素血清濃度分別為1.25 μg/mL(低)，10 μg/mL(中)，100 μg/mL(高)，按1.2.3項下進行處理，低、中、高3個濃度日內分別平行測定5次，得日內精密度。每天測定1次，連續測定3天，得日間精密度。

④ 回收率實驗：精密移取180 μL空白血清,加入萬古霉素、去甲萬古霉素標準液各20 μL，使萬古霉素、去甲萬古霉素血清濃度分別為1.25 μg/mL(低)，10 μg/mL(中)，100 μg/ml(高)，按1.2.3項下進行處理，低、中、高3個濃度日內分別平行測定5次，將儀器檢測到的濃度除以實際配置的濃度，即得方法回收率。

2 結果

2.1 色譜峰分離情況 本實驗條件下，萬古霉素和去甲萬古霉素與血清中的組分分離良好且峰形較好，空白血清中無干擾雜質峰。萬古霉素和去甲萬古霉素的相對保留時間分別為15.998 min、11.932 min。古霉素、去甲萬古霉素血清樣品色譜圖見圖1。

圖1 萬古霉素和去甲萬古霉素的血清色譜圖A：空白血清； B：空白血清+去甲萬古霉素； C：空白血清+萬古霉素； D：空白血清+去甲萬古霉素+萬古霉素Fig.1 HPLC chromatograms of serum Vancomycin and NorvancomycinA: blank serum; B: serum of blank and Norvancomycin-treated patients; C: serum of blank and Vancomycin-treated patients; D: blank serum containing Vancomycin and Norvancomycin

2.2 標準曲線及線性關系 萬古霉素和去甲萬古霉素均在1.25～100 μg/mL范圍內線性關系良好。萬古霉素的標準曲線回歸方程：Y=15.315X-0.7896，R2=0.9996(n=7)；去甲萬古霉素的標準曲線回歸方程：Y=6.7626X-0.1554，R2=0.9996(n=7)；萬古霉素和去甲萬古霉素的標準曲線見圖2和圖3。

圖2 萬古霉素標準曲線Fig.2 Standard curve of Vancomycin

圖3 去甲萬古霉素標準曲線Fig.3 Standard curve of Norvancomycin

2.3 精密度和回收率 低、中、高3個濃度萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率和精密度的結果見表1。由表1可知，萬古霉素和去甲萬古霉素的回收率和精密度均符合《中國藥典》生物樣本分析相關規定。

表1 萬古霉素與去甲萬古霉素的回收率和精密度(n=5)Tab.1 Results of the recovery rates and precision of vancomycin and norvancomycin in serum(n=5)

3 討論

查閱相關文獻[13-14]，常采用pH=3.6的甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液(10:5:85)為流動相，地塞米松磷酸鈉、甲硝唑、替考拉寧等作為內標物，液-液萃取法、直接沉淀法或2者相結合等方法進行血清樣品處理。但經反復實驗發現，流動相的配比、pH值、內標物質及血樣處理方法對出峰時間、峰形及分離效果均有較大影響。本試驗最終采用甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液(9.5:2.5:88)為流動相，萬古霉素和去甲萬古霉素互為內標物質，選擇乙腈-6% 高氯酸(1︰6)作為沉淀劑,沉淀較為完全，分離效果較好，操作簡便且靈敏度較好，萬古霉素和去甲萬古霉素與血清雜質分離更加完全，且峰形更好，保留時間合適，檢測效率高，更適于臨床血藥濃度檢測和藥代動力學研究。

綜上所述，本實驗成功通過試驗研究篩選出靈敏度高、選擇性好、專屬性強、分析快速等優點的人血清中萬古霉素和去甲萬古霉素的高效液相色譜測定法，快速簡捷、采血量少，其準確度和精密度良好，符合生物樣本分析要求，可滿足臨床開展治療藥物監測(therapeutic drug monitoring，TDM)和進行人體藥代動力學研究的需要。

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(編校：王冬梅)

Determination of Vancomycin and Norvancomycin in human serum by HPLC

LIU BinΔ, TONG Tong

(Department of Pharmacy, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001,China)

ObjectiveTo establish HPLC method for fast, effective, simultaneous determination of Vancomycin and Norvancomycin in serum.MethodsThe separation was achieved on the Hypersil ODS2(250 mm×4.6 mm,5 μm)with methanol-acetonitrile-a mixture of potassium phosphate(9.5:2.5:88) as the mobile phase.The flow rate was 1.0 mL/min. The UV detecting wavelength was 280 nm. The temperature of the column was 35 ℃. Vancomycin and Norvancomycin were used as the internal standard for each other.ResultsVancomycin and Norvancomycin blood concentration were in well linearity in the range of 1.25-100 μg/mL,R2=0.9996.The average method recovery rate of three concentrations were 96.88%,99.50%,105.01% respectively, the average method recovery rate of three concentrations were 94.40%,103.90,103.81%respectively, the intra-day and inter-day RSD were less than 5%.ConclusionThe HPLC method is proved to be simple,sensitive, accurate and precise in which little blood sample is taken, thus it is suitable for the therapeutic drug monitoring(TDM) and pharmacokinetic study of Vancomycin and Norvancomycin.

HPLC; Vancomycin; Norvancomycin; human serum; plasma concentration

劉斌，通信作者，男，碩士，副主任藥師，研究方向：臨床藥理學，E-mail：liubinhf@sina.com。

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1005-1678(2015)11-0172-03