新型希夫堿釕配合物的抗腫瘤作用研究

趙成亮，張寶琦，杜元良，閆鶴，張四喜，陳賓Δ

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；2.吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

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新型希夫堿釕配合物的抗腫瘤作用研究

趙成亮1，張寶琦1，杜元良1，閆鶴2，張四喜2，陳賓1Δ

(1.承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院，河北 承德 067000；2.吉林大學第一醫(yī)院，吉林 長春 130021)

目的 探討新型希夫堿釕配合物對胃癌SGC-7901細胞生長增殖和細胞凋亡的影響。方法 將胃癌SGC-7901細胞根據(jù)不同濃度的新型希夫堿釕配合物處理分為10、30、50 μmol/L組,另設DMSO空白組。MTT法檢測新型希夫堿釕配合物對胃癌細胞增殖的影響，流式細胞術檢測各組細胞凋亡及細胞周期變化。結果 MTT結果顯示SGC-7901細胞生長抑制率隨新型希夫堿釕配合物濃度的增加而增加，各劑量組在24、48、72 h的抑制率均顯著高于空白組(P<0.05)。流式細胞術結果顯示濃度為10、30、50 μmol/L的新型希夫堿釕配合物組的細胞凋亡率分別為(17.64±1.21)%、(26.47±0.61)%、(55.63±1.49)%，均顯著高于空白組(P<0.05)。隨著新型希夫堿釕配合物濃度升高，G1期細胞所占的百分比逐漸增加。結論 新型希夫堿釕配合物能夠抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖，促進細胞凋亡，并使細胞停滯在G1期。

新型希夫堿釕配合物； 胃癌SGC-7901細胞；細胞增殖；細胞凋亡；細胞周期

自從Rosenberg[1]發(fā)現(xiàn)順鉑的抗腫瘤效應以來，化療在治療腫瘤過程中的地位與日俱增。近年來隨著順鉑、卡鉑等化療藥物應用于臨床，在抑制腫瘤生長的同時耐藥性也日益突出。探索新的抗腫瘤藥物勢在必行。釕以及其配合物由于毒性較低、容易吸收、體內(nèi)排泄快等優(yōu)點，被視為最有潛力的抗腫瘤藥物之一[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)希夫堿具有抗腫瘤、抑菌、清除自由基等作用[1,4]，且其氮原子上的孤對電子極易與多種金屬元素形成配合物而具備新的作用[5]。本研究采用的新型希夫堿釕配合物，為新型呋喃酰基吡唑啉酮縮芳胺希夫堿釕配合物(見圖1)，國際上尚無對該物質的報道，本文旨在通過研究其抗腫瘤作用為新型抗腫瘤藥物應用于臨床提供理論基礎。

圖1 新型希夫堿釕配合物結構式Fig.1 The constitutional formula of a novel schiff base ruthenium coordination compound

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株：胃癌SGC-7901細胞，由吉林大學白求恩醫(yī)學院微生物實驗室提供。

1.1.2 新型希夫堿釕配合物：由河北民族師范學院化學系張恒強博士惠贈。

1.1.3 主要試劑：胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、青鏈霉素、PBS磷酸鹽緩沖液、RPMI-1640培養(yǎng)液(均購自Hyclone)；噻唑藍(Amersco公司)；PI染色試劑盒、FITC/PI細胞凋亡試劑盒(上海貝博生物)。

1.1.4 主要儀器：微孔濾器(Millipore公司)；96孔培養(yǎng)板(Coring公司)；Nanodrop2000分光光度計(Thermo公司)；CO2培養(yǎng)箱(Forma公司)；FaCS CantoTM II system流式細胞儀(Becton-Dickinson Bioscience公司)。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制：新型希夫堿釕配合物1.8g溶于1L DMSO中，濃度為0.1 mmol/L，再用RPMI-1640完全培養(yǎng)液稀釋成10、30、50 μmol/L溶液，用微孔濾器過濾，于4 ℃保存。

1.2.2 MTT實驗：將處于對數(shù)生長期的胃癌細胞株SGC-7901，用胰蛋白酶消化成細胞懸液。將SGC-7901細胞以4×104個/孔的密度接種于96孔板，分別加入10、30、50 μmol/L的新型希夫堿釕配合物，即10 μmol/L組、30 μmol/L組、50 μmol/L組。空白組中加入0.1%DMSO。作用24、48、72 h后加入20 μLMTT溶液(5 mg/mL)，37 ℃，5%CO2條件下培養(yǎng)4 h。加入150 μL DMSO溶解后，酶標儀上測定OD490。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡：細胞分組同1.2.2。加不同濃度新型希夫堿釕配合物作用于SGC-7901細胞48 h，收集細胞，用4 ℃預冷的PBS洗滌2次，加250 μL結合緩沖液重懸細胞，調節(jié)濃度為1×106個/mL。取100 μL細胞懸液于流式管中，再加入5 μL AnnexinV/FITC和10 μL PI(20 μg/mL)，混勻后室溫避光孵育15 min，之后加入400 μL PBS，使用流式細胞儀分析細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞周期：細胞分組同1.2.2。加不同濃度新型希夫堿釕配合物作用于SGC-7901細胞48 h后，收集細胞，70%冰醋酸固定，用PBS洗滌后1000 r/min離心5 min，加入1 mg/mL RNase A和50 μg/mL PI，反應并染色30 min，用流式細胞儀檢測細胞并使用Modfit軟件分析各組細胞周期分布情況。實驗重復3次。

2 結果

2.1 MTT實驗 不同濃度新型希夫堿釕配合物作用于胃癌SGC-7901細胞24、48、96 h，抑制率明顯上升，與空白相比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其中以50 μmol/L新型希夫堿釕配合物作用胃癌SGC-7901細胞72 h對胃癌細胞的抑制作用最明顯，達66.39%。見表1。

表1 新型希夫堿釕配合物對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響±s，n=5)Tab.1 Effect of a novel schiff base ruthenium coordination compound on cell proliferation of gastric cancer SGC-7901 ±s，n=5)

*P<0.05，與空白組相比，compared with blank group

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡 不同濃度新型希夫堿釕配合物作用胃癌細胞SGC-7901 48 h后的流式細胞檢測的凋亡結果顯示，空白組的細胞凋亡率為(11.35±1.18)%，濃度為10、30、50 μmol/L的新型希夫堿釕配合物的抑制率分別為(17.64±1.21)%、(26.47±0.61)%、(55.63±1.49)%。與空白組相比差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡Fig.2 Cell apoptosis detected by flow cytometry instrument

2.3 流式細胞術檢測細胞周期分布 流式細胞結果顯示，隨著新型希夫堿釕配合物濃度的增加，G1期細胞所占的百分比逐漸增加，而S期細胞所占的百分比明顯減少，G2期的細胞數(shù)量未見明顯的變化。這說明細胞的生長停滯在G1期，新型希夫堿釕配合物可通過阻止細胞周期由G1期進入S期和G2期。從而延長細胞的生長周期，降低細胞增殖速率。見圖3。

圖3 流式細胞儀檢測細胞周期Fig.3 Cell cycle detected by flow cytometry instrument

組別G1(%)S(%)G2(%)空白組25.35±1.0669.46±1.376.19±0.9410μmol/L組31.19±1.3260.95±1.647.86±0.7830μmol/L組49.67±1.4343.22±1.167.11±0.8350μmol/L組72.34±1.5122.17±1.345.49±0.97

3 討論

釕的配合物因其具有抗腫瘤的活性而逐漸被人們熟知。研究認為釕將取代鉑在抗腫瘤中發(fā)揮巨大的作用[6]。NAMI-A是第一個進入臨床的釕配合物，研究發(fā)現(xiàn)其對肺癌和乳腺癌的轉移表現(xiàn)出特別的活性，但對原發(fā)性腫瘤及體外活性仍不理想[7-8]。之后合成的KP1019等釕配合物，抗腫瘤活性上逐漸突凸，且副作用輕微[9-11]。

近年來越來越多的新型釕配合物被合成，同時這些新型配合物也具有較好的抗腫瘤活性。Chen等[12]合成了[Ru(bpy)2(PAIDH)]2+,[Ru(phen)2(PAIDH)]2+,[Ru(dmp)2(PAIDH)]2+和[Ru(dip)2(PAIDH)]2+4種釕配合物并證實其具有抗腫瘤作用。本文采用新型希夫堿釕配合物，MTT實驗顯示其能抑制胃癌SGC-7901細胞的增殖，且濃度為50 μmol/L的新型希夫堿釕配合物作用細胞72h后對細胞的抑制率達(66.39±0.01)%。流式結果顯示希夫堿釕配合物能促進SGC-790細胞凋亡。Yu等[13]對合成的釕(II)β-咔啉配合物[Ru(tpy)(Nh)3]2+進行研究，發(fā)現(xiàn)其能抑制小鼠乳腺癌細胞MCF-7和HepG2的生長，作用機制可能與p53和p21蛋白表達有關。p53作為抑癌基因能與p21結合構成細胞周期G1的檢測站，使腫瘤細胞的生長停滯在G1期。進而S期和G2期的細胞減少，細胞周期延長，生長遲緩。本研究結果顯示，新型希夫堿釕配合物作用于胃癌SGC-7901細胞后可使細胞停滯在G1期，與上述研究結果相同。但是否也與p53及p21蛋白的表達有關，仍需要進一步實驗證實。

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(編校：吳茜，王儼儼)

Study on antitumor effect of a novel schiff base ruthenium coordination compound

ZHAO Cheng-liang1, ZHANG Bao-qi1, DU Yuan-liang1, YAN He2, ZHANG Si-xi2, CHEN Bin1Δ

(1.The Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Chengde 067000, China; 2. The First Hospital of Jilin University, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo study effect of a novel schiff base ruthenium coordination compound on cell proliferation and apoptosis of gastric cancer SGC-7901 cell.MethodGastric cancer SGC-7901 cell were divided into four groups according to different treatment of novel schiff base ruthenium coordination compound (concentration of 10, 30, 50 μmol/L) and blank group with DMSO. Cell proliferation was detected by MTT assay, cell apoptosis and cell cycle were analysed by flow cytometry.ResultsMTT results showed the inhibitory effect of novel schiff base ruthenium coordination compound on SGC-7901 cell enhanced with the increase of its concentration, and inhibitory rates were higher than that of blank group at 24, 48, 72 h. Flow cytometry results showed the apoptosis rate of novel ruthenium coordination compound groups of 10, 30, 50 μmol/L were (17.64±1.21)%, (26.47±0.61)%, (55.63±1.49)%, respectively, all higher than that of blank group (P<0.05). The cell proportion of G1 phase increased with the increasing of the novel schiff base ruthenium coordination.ConclusionA novel schiff base ruthenium coordination compound could inhibit the growth of gastric cancer SGC-7901 cells, promote apoptosis and arrest gastric cancer SGC-7901 cells at G1.

a novel schiff base ruthenium coordination compound;gastric cancer SGC-7901 cells; cell proliferation; cell apoptosis; cell cycle

河北省衛(wèi)生廳科研基金(ZL20140116)；吳階平醫(yī)學基金會臨床科研專項資助基金(320.6750.14119)

趙成亮，男，主治醫(yī)師，研究方向：腫瘤及藥物化學，E-mail：38221965@qq.com；陳賓，通訊作者，男，主任醫(yī)師，研究方向：脊柱外科及脊柱腫瘤，E-mail：514329822@qq.com。

R73-3

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1005-1678(2015)08-0031-04