葛根素精制的工藝研究

羅建成，劉鳳霞

(南陽(yáng)理工學(xué)院 生化學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004)

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葛根素精制的工藝研究

羅建成，劉鳳霞

(南陽(yáng)理工學(xué)院 生化學(xué)院，河南 南陽(yáng) 473004)

目的 研究葛根素精制的最佳組合工藝。方法 利用已研究的溶解劑、除雜劑和沉淀劑選擇結(jié)果以及樹(shù)脂、氧化鋁、硅膠、粉煤灰、活性炭的柱層析方法進(jìn)行組合工藝研究。結(jié)果 優(yōu)化的3個(gè)工藝產(chǎn)品的平均純度分別為99.06052%、99.22620%和99.69880%，回收率的平均值分別為44.180%、44.438%和42.642%。結(jié)論 本研究?jī)?yōu)化的最佳工藝可行，葛根素純度超過(guò)99%，回收率達(dá)40%以上。

葛根素；組合工藝實(shí)驗(yàn)；工藝優(yōu)化；純度；收率

葛根中的有效成分葛根黃酮(以葛根素為代表)，具有降低心肌耗氧量，增加冠脈、腦血管血流量、緩解心絞痛及抗心律失常等藥理作用[1]，臨床主要用于治療冠心病、心絞痛、眼底病、突發(fā)性耳聾、偏頭痛、頸椎病等[2]，可制成治療心腦血管系統(tǒng)疾病的藥品。迄今國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上可見(jiàn)含葛根異黃酮的制劑藥品有葛根浸膏制劑愈風(fēng)寧心片及以葛根素為主要成分的葛根素注射劑。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[3]，葛根素系列藥品對(duì)心腦血管疾病治愈率達(dá)97.6%，是治療疑難病和通發(fā)病的新藥，深受患者歡迎。

我國(guó)葛根資源非常豐富，而葛根素的藥用價(jià)值也越來(lái)越受到人們的重視，因此研究開(kāi)發(fā)從葛根中分離純化得到高純度葛根素的優(yōu)化工藝路線(xiàn)[4-5]，不僅有利于充分合理地利用葛根資源，通過(guò)中藥材深加工增加產(chǎn)品的附加值，使藥材加工企業(yè)和藥農(nóng)增收，而且對(duì)實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化，使中醫(yī)藥產(chǎn)品走向世界具有非常重要的意義[6]。而且國(guó)家藥典規(guī)定[7]葛根素針劑生產(chǎn)需用97%以上的純品原料，目前市售產(chǎn)品純度很少達(dá)97%。因此，葛根素的高效精制純化受到高度關(guān)注。

目前國(guó)內(nèi)外葛根素進(jìn)一步的精制純化方法大都以結(jié)晶、重結(jié)晶為主。其結(jié)晶過(guò)程多采用傳統(tǒng)的方法，產(chǎn)品質(zhì)量較差，從而嚴(yán)重影響后續(xù)藥品的效能[8]。因此有必要對(duì)分離得到的葛根素粗品進(jìn)行純化精制工藝研究，使其含量達(dá)到97%以上，從而達(dá)到醫(yī)用級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行溶解劑、除雜劑和沉淀劑選擇實(shí)驗(yàn)以及樹(shù)脂、氧化鋁、硅膠、粉煤灰、活性炭的柱層析實(shí)驗(yàn)，研究將多種方法有機(jī)結(jié)合的最佳方法，以期使葛根素的純度超過(guò)99%，收率超過(guò)40%。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 81%葛根素粗品(購(gòu)自河南宛西制藥廠(chǎng)，批號(hào)2007.7.18)； 99.7%的葛根素(購(gòu)自河南宛西制藥廠(chǎng)，批號(hào)2008.6.10)；100～200目中性氧化鋁(購(gòu)自上海五四化學(xué)試劑有限公司)；80～100目硅膠(購(gòu)自青島海浪化學(xué)試劑有限公司)；大孔樹(shù)脂(HZ-816、HZ-802、X-5、HPD-100A、HPD-100、HPD-450、HPD-400A、HPD-600、AB-8，購(gòu)自上海勁凱樹(shù)脂有限公司)。無(wú)水乙醇、無(wú)水甲醇、冰乙酸和三氯甲烷均為分析純。灰柱是指粉煤灰置高溫爐中，400 ℃燒2 h。將灼燒后粉煤灰過(guò)篩，分為80～100目和100～200目，然后裝柱(以下簡(jiǎn)稱(chēng)灰柱)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 L-7100二元梯度液相色譜儀、UV-VIS檢測(cè)器(購(gòu)自HITACHI公司)。

1.3 方法

1.3.1 設(shè)計(jì)組合實(shí)驗(yàn)方法：

1.3.2 優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)研究：

1.3.3 產(chǎn)品檢測(cè)：色譜條件為色譜柱：Turner C18H37(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動(dòng)相：(A：乙醇):(B：水)，梯度洗脫程序?yàn)椋?～2 min(0:100)；2～4 min(11:89)；4～13 min(17:83)；13～16 min(35:65)；16～22 min(78:22)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm；理論板數(shù)按葛根素計(jì)，不低于3000，與內(nèi)標(biāo)峰分離度大于5。進(jìn)樣量20 μL。

1.3.4 驗(yàn)證試驗(yàn)：對(duì)上述3種優(yōu)化工藝分別重復(fù)5次，檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 設(shè)計(jì)組合工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)1所得葛根素純度為89.065%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品第一峰為0.149%、第三峰為10.775%，其他峰為0.010%。見(jiàn)圖1。

圖1 產(chǎn)品1的色譜圖Fig.1 Chromatogram of product 1

實(shí)驗(yàn)2葛根素純度為90.931%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品第一峰為0.507%、第三峰為8.488%，其他峰為0.074%。見(jiàn)圖2。

圖2 產(chǎn)品2的色譜圖Fig.2 Chromatogram of product 2

實(shí)驗(yàn)3葛根素純度為91.606%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品第一峰為0.218%、第三峰為7.660%，其他峰為0.515%。見(jiàn)圖3。

圖3 產(chǎn)品3的色譜圖Fig.3 Chromatogram of product 3

實(shí)驗(yàn)4葛根素純度為91.677%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品第一峰為0.264%、第三峰為7.320%，其他峰為0.740%。見(jiàn)圖4。

圖4 產(chǎn)品4的色譜圖Fig.4 Chromatogram of product 4

實(shí)驗(yàn)5葛根素純度為95.402%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品第一峰為0.084%、第三峰為4.256%，其他峰為0.259%。見(jiàn)圖5。

圖5 產(chǎn)品5的色譜圖Fig.5 Chromatogram of product 5

實(shí)驗(yàn)6葛根素純度為96.6004%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品無(wú)第一峰、第三峰為1.1051%，其他峰為0.155%。見(jiàn)圖6。

圖6 產(chǎn)品6的色譜圖Fig.6 Chromatogram of product 6

實(shí)驗(yàn)7葛根素純度為98.0136%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品無(wú)第一峰、第三峰為0.9809%，其他峰為0.9815%。見(jiàn)圖7。

圖7 產(chǎn)品7的色譜圖Fig.7 Chromatogram of product 7

實(shí)驗(yàn)8葛根素純度為98.412%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品第一峰為0.053%、第三峰為0.4056%，其他峰為0.5352%。見(jiàn)圖8。

圖8 產(chǎn)品8的色譜圖Fig.8 Chromatogram of product 8

2.2 優(yōu)化工藝實(shí)驗(yàn)結(jié)果 該實(shí)驗(yàn)葛根素純度為99.0456%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品無(wú)第一峰，第三峰為0.9544%。見(jiàn)圖9。

圖9 優(yōu)化工藝產(chǎn)品1的色譜圖Fig.9 Chromatogram of the optimization technology product 1

該實(shí)驗(yàn)葛根素純度為99.0784%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品第一峰為0.3726，第三峰為0.5490%。見(jiàn)圖10。

圖10 優(yōu)化工藝產(chǎn)品2的色譜圖Fig.10 Chromatogram of the optimization technology product 2

該實(shí)驗(yàn)葛根素純度為99.877%。實(shí)驗(yàn)所得產(chǎn)品無(wú)第一峰，第三峰為0.9123%。見(jiàn)圖11。

圖11 優(yōu)化工藝產(chǎn)品3的色譜圖Fig.11 Chromatogram of the optimization technology product 3

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 優(yōu)化工藝1、2、3的平均純度分別為99.06052%、99.22620%和99.69880%，RSD值分別為0.116%、0.148%和0.194%，見(jiàn)表1。優(yōu)化工藝1、2、3的平均回收率分別為44.180%、44.438%和42.642%，RSD值分別為4.343%、3.067%和3.837%。RSD值均未超過(guò)5%，因此3種工藝是可靠的，見(jiàn)表2。

表1 純度驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Validation test results of purity

表2 回收率驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Validation test results of recovery

3 討論

根據(jù)上述8種組合工藝實(shí)驗(yàn)以及優(yōu)化的3種工藝實(shí)驗(yàn)，本研究認(rèn)為：三氯甲烷和乙醚萃取、冰乙酸沉淀對(duì)去除第三峰對(duì)應(yīng)雜質(zhì)均有效，且冰乙酸沉淀和三氯甲烷萃取共用效果更好，但不能完全去除第三峰；實(shí)驗(yàn)沒(méi)有用水和冰乙酸及有機(jī)溶劑除雜，則純度較低。實(shí)驗(yàn)沒(méi)有用灰柱除雜，則純度較低。實(shí)驗(yàn)水洗少，或酸洗少，或過(guò)灰柱少，則純度較低。

按照組合工藝所分離葛根素的純度達(dá)到99%以上，其回收率在42%～45%，雖然回收率較高，但仍需要進(jìn)一步研究以提高收率；組合工藝的步驟太繁瑣，需要進(jìn)一步優(yōu)化工藝過(guò)程，以降低成本，節(jié)省時(shí)間；粉煤灰的處理方法及其脫色機(jī)理有待進(jìn)一步的研究；連續(xù)水洗5次后樣品顏色變暗，其原因不詳，需進(jìn)一步研究探討。

各方法有機(jī)結(jié)合在一起能夠更有效的提純葛根素，使葛根素的純度超過(guò)99%，回收率在42%～45%，比張仲景現(xiàn)代中藥有限公司的回收率(12%～18%)高出27%～30%。因此本研究確定的最佳工藝可行。可使葛根素純度超過(guò)99%，回收率達(dá)40%以上。

[1] 潘見(jiàn)，戴郁青，袁傳勛.葛根素配位萃取探討[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002,25(5)：650-653.

[2] 劉永錄，趙引娣，楊會(huì)池.葛根保健作用的化學(xué)及藥理基礎(chǔ)研究近況[J].河北中醫(yī)，2008，30(4)：435-437.

[3] 范禮理，趙德華，趙敏琦，等.葛根黃酮抗心律失常作用[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，1985，20(4)：647.

[4] Rong H,Stevens JF.Deinzer ML,et at.Identification of Isoflavones in the Roots of Pueraria lobata[J].Planta Med,1998,64(7):620-627.

[5] 潘娓婕，劉謙光.酸水解法從葛根中提取分離葛根素和大豆苷元[J].天然產(chǎn)物研究與開(kāi)發(fā)，2000，12(6)：66-69.

[6] 翁良安.葛根素生產(chǎn)工藝的改進(jìn)[D].天津：天津大學(xué)，2004.

[7] 中國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典一部[M].北京，化學(xué)工業(yè)出版社，2000：140.

[8] 王華峰.電磁誘導(dǎo)葛根素結(jié)晶純化技術(shù)研究[D].合肥工業(yè)大學(xué)，2004.

(編校：王冬梅)

Study on process of puerarin refined

LUO Jian-cheng, LIU Feng-xia

(College of Biological and Chemical Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473004, China)

ObjectiveTo study the best process of puerarin refined.MethodsResults of the research on the selection of dissolved agent, agent and precipitator, and column chromatography of the resin, alumina, silica gel, fly ash and activated carbon were used to study the combined process.ResultsThe average purity of optimization of the three craft products were 99.06052%, 99.22620% and 99.69880%.The yield of average values were 44.180%, 44.438% and 42.642%.ConclusionThis study optimized the optimum process is feasible, puerarin purity is more than 99%, the yield is above 40%.

puerarin; combination technology experiment; process optimization; purity； yield

河南省科學(xué)技術(shù)廳2005年科技發(fā)展計(jì)劃(0524420024)

羅建成，男，碩士，副教授，研究方向：生物技術(shù)，E-mail：ny-explorer@163.com。

Q584

A

1005-1678(2015)06-0150-04