阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊在抗乙肝病毒治療過程中的宿主免疫應答研究

張云濤,張四喜,李焱Δ

(1.河北省唐山市傳染病醫院，河北 唐山 063000；2.吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

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阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊在抗乙肝病毒治療過程中的宿主免疫應答研究

張云濤1,張四喜2,李焱1Δ

(1.河北省唐山市傳染病醫院，河北 唐山 063000；2.吉林大學第一醫院，吉林 長春 130021)

目的 探討阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊在治療慢性乙型肝炎過程中對宿住免疫應答的影響。方法 選擇2010年3月～2014年10月在唐山市傳染病醫院門診或住院的100名慢性乙型肝炎患者，隨機分為阿德福韋酯治療組及阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊治療組，每組50例。檢測2組患者治療前后AST、ALT、HBsAg和HBV DNA水平。采用流式技術檢測2組患者CD3+CD56+、CD244+NK、CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞以及血清中CD4+T相關細胞因子的含量。結果 治療后各時點2組患者AST、ALT、HBV-DNA水平均較治療前顯著下降(P<0.05)，且治療3個月、6個月后阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組的AST、ALT水平顯著低于阿德福韋酯組(P<0.05)，但2組HBV-DNA相比差異無統計學意義。除治療后3個月外，2組患者治療后6、9、12個月的HBsAg水平均較治療前顯著降低(P<0.05)，但2組間比較差異無統計學意義。治療后6、9、12個月，2組患者外周血中CD3-CD56+NK細胞均較治療前顯著增高(P<0.05)，且阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組顯著高于阿德福韋酯組(P<0.05)。治療后各時點2組患者外周血中的CD244+NK、CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞均較治療前顯著增高(P<0.05)，且阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組顯著高于阿德福韋酯組(P<0.05)。但治療后各時點2組CD3+CD8+T細胞均顯著低于治療前(P<0.05)，2組比較，除治療后3個月外，其余各時點阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組CD3+CD8+T細胞均較阿德福韋酯組更低(P<0.05)。治療后2組患者血清中各細胞因子均顯著增加(P<0.05)。且阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組較阿德福韋酯組各因子水平更高(P<0.05)。結論 阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊治療慢性乙型肝炎，能顯著降低患者AST、ALT、HBV-DNA及HBsAg的情況，促進NK細胞、T/B細胞表達和T細胞分泌細胞因子表達，且效果優于單純使用阿德福韋酯。

慢性乙型肝炎；阿德福韋酯；扶正化瘀膠囊；NK細胞；T/B細胞；細胞因子

乙型肝炎病毒感染是慢性肝炎的常見致病因素，不僅嚴重威脅人類的健康，同時消耗巨大的財力。雖然有乙肝疫苗接種的普及，以及干擾素、核苷類似物在臨床的廣泛應用，但目前臨床上不斷出現乙肝病毒耐藥的報道，使得慢性乙型肝炎的治療再次陷入僵局。扶正化瘀膠囊是由桃仁、五味子、丹參、發酵蟲草菌粉等為主要成分的中藥制劑。研究發現其能通過抑制肝星狀細胞活化增殖，進而減少細胞外基質過度沉積并促使其降解，以達到減輕肝纖維化的目的[1-2]。同時扶正化瘀膠囊還可抑制纖維連接蛋白對肝星狀細胞的活化[3]。目前阿德福韋酯與扶正化瘀膠囊在臨床治療過程當中應用廣泛，但并無2者聯用對慢性乙肝患者免疫應答情況的相關報道。本實驗旨在探討核苷類似物阿德福韋酯和扶正化瘀膠囊聯用對慢性乙型肝炎患者免疫應答情況的影響，以期為臨床用藥提供免疫學證據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2010年3月～2014年10月在唐山市傳染病醫院門診或住院的100名慢性乙型肝炎患者為研究對象。所有入選病例均符合《病毒性肝炎防治方案》(2005)中的診斷標準[4]。排除合并有其他肝炎，慢性心、腦、腎臟疾病的患者及妊娠或哺乳期婦女。其中男性患者67名，平均(48.23±2.67)歲，女性患者33名，平均(50.31±1.71)歲。將100名患者隨機均分成2組，每組50例。對照組患者給與阿德福韋酯10 mg，每天1次口服，治療組在給予阿德福韋酯基礎上加用扶正化瘀膠囊1.5g，每天分3次口服。治療療程為1年。

1.2 主要試劑及儀器 扶正化瘀膠囊(上海黃海制藥廠，國藥準字200Z20073)。鼠抗人CD3-FITC、CD244-PE、CD4-PerCP、CD3-PerCP、CD8-PE，Th1/Th2 (IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ)試劑盒(美國R&D公司)；CBA試劑盒(美國BD公司)。

FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD公司)；5702RH臺式控溫離心機(德國Eppendorf公司)；Abbott I 2000化學發光免疫分析儀(美國Abbott公司)；CO2培養箱(美國Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 采集所有患者治療前及治療后第3、6、9、12個月的外周靜脈血10 mL，一部分于4 ℃，1500 r/min離心10 min，分離外周血單核細胞及血清。另一部分用于HBV-DNA、乙肝兩對半、ALT、AST等臨床指標的檢測。

1.3.2 外周血NK細胞檢測 在流式管中加入50 μL抗凝血和10 μL熒光素標記的抗體，避光孵育30 min。之后再加入500 μL紅細胞裂解液，混勻后避光孵育7 min。PBS洗滌3遍，棄去上清，每管加入200 μL含PBS的單細胞懸液，充分混勻后，上流式檢測。

1.3.3 外周血T細胞的檢測 參照馬亮[5]的方法并稍作修改，進行外周血單個核細胞的分離及細胞計數。在流式管中加入100 μL新鮮分離的PBMC和10 μL特異性熒光素標記的抗體，同型對照管中加入相應的同型抗體，混勻后避光孵育30 min。之后加入2～3 mL PBS，1200 r/min離心10 min，洗滌3次，棄上清，加1%多聚甲醛固定，用流式細胞儀檢測。

1.3.4 Th1/Th2細胞因子檢測 按照Th1/Th2細胞因子試劑盒說明書操作。

2 結果

2.1 治療前后2組患者AST、ALT、HBV-DNA及HBsAg的變化 2組患者AST、ALT在治療3、6、9、12個月均較治療前均有顯著下降(P<0.05)。且治療3、6個月后阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組的AST、ALT顯著低于阿德福韋酯組(P<0.05)。2組患者治療后各時點HBV-DNA水平均較治療前顯著降低(P<0.05)，但組間比較差異無統計學意義。除治療后3個月外，2組患者治療后6、9、12個月HBsAg水平均較治療前顯著降低(P<0.05)，但2組間比較差異無統計學意義。見表1。

表1 治療前后2組患者AST、ALT、HBV-DNA和HBsAg水平變化Tab.1 Comparison of AST, ALT, HBV DNA and HBsAg levels pre- and post-treatment between two ±s,n=50)

*P<0.05，與同組治療前相比，compared with pre-treatment in the same group；#P<0.05，與同時點阿德福韋酯組相比，compared with Adefovir ester treatment group at the same time

2.2 治療前后2組患者外周血中NK細胞變化比較 流式結果顯示：與治療前相比，2組患者治療6、9、12個月后外周血中CD3-CD56+NK細胞比例顯著增高(P<0.05)，且阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組患者外周血中CD3-CD56+NK細胞顯著高于阿德福韋酯組(P<0.05)。2組患者治療后各時點CD244+NK細胞比例均較治療前顯著增高(P<0.05)，且阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組水平顯著高于阿德福韋酯組(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 2組患者外周血中CD3-CD56+NK及CD244+NK細胞水平變化Fig.1 Changes of CD3-CD56+NK cell and CD244 + NK cell ratio in peripheral blood of two groups

組別時間CD3-CD56+NKCells(105/mL)CD244+NKCells(104/mL)阿德福韋酯組治療前0.98±0.171.04±0.21第3個月1.19±0.261.26±0.18*第6個月1.72±0.44*1.52±0.46*第9個月1.90±0.71*1.81±0.47*第12個月2.31±0.81*2.36±0.66*阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組治療前1.16±0.231.17±0.19第3個月1.23±0.211.33±0.20*#第6個月1.86±0.51*#1.67±0.51*#第9個月2.15±0.64*#2.24±0.53*#第12個月2.42±0.73*#2.68±0.74*#

*P<0.05，與同組治療前相比，compared with pre-treatment in the same group；#P<0.05，與同時點阿德福韋酯組相比，compared with Adefovir ester treatment group at the same time

2.3 外周血T細胞的檢測 流式結果顯示：治療后各時點2組患者外周血中的CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞均顯著增高(P<0.05)，且阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組顯著高于阿德福韋酯組(P<0.05)。治療后各時點2組患者外周血中CD3+CD8+T細胞均顯著降低(P<0.05)。組間相比，除治療后3個月外，其余時間點阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組均低于阿德福韋酯組(P<0.05)，見圖2、表3。

圖2 2組患者外周血T細胞水平變化Fig.2 Changes of T cells in peripheral blood between two groups

組別時間TotalCD3+TCells(105/mL)CD3+CD4+TCells(105/mL)CD3+CD8+TCells(105/mL)阿德福韋酯組治療前6.68±1.234.26±0.985.87±0.97第3個月7.35±1.62*5.89±1.32*5.11±0.84*第6個月8.86±1.78*6.14±1.40*4.73±0.79*第9個月9.77±1.65*7.88±1.62*3.64±0.51*第12個月9.62±1.74*8.25±1.75*3.58±0.53*阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組治療前6.84±1.354.37±0.925.90±1.01第3個月8.24±1.97*#6.04±1.21*#5.06±0.73*第6個月9.01±2.06*#6.42±1.54*#4.56±0.82*#第9個月9.83±1.76*#7.93±1.73*#3.29±0.49*#第12個月10.32±1.61*#9.47±1.86*#3.17±0.40*#

*P<0.05，與同組治療前相比，compared with pre-treatment in the same group；#P<0.05，與同時點阿德福韋酯組相比，compared with Adefovir ester treatment group at the same time

2.4 2組患者Th1/Th2型細胞因子的動態變化 流式蛋白定量結果顯示：治療前，阿德福韋酯組IL2-CD4+T、IFN-γ+CD4+T、TNF-α+CD4+T、IL-4+CD4+T、IL-6+CD4+T、IL-10+CD4+T為10.75±1.64、8.23±1.04、7.86±0.76、3.75±0.39、2.08±0.42、2.49±0.51，均隨時間的變化逐漸增加(P<0.05)，最高到第12個月時分別為25.08±3.37、19.14±4.13、18.87±3.21、14.45±2.89、13.26±2.64、9.72±1.72；阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組上述指標在治療前分別為11.89±1.85、9.63±1.22、8.35±0.83、3.41±0.22、2.11±0.56、2.63±0.59，均隨時間的變化逐漸增加(P<0.05)，最高到第12個月時分別為26.94±3.06、19.58±3.81、19.94±3.53、15.67±3.22、14.45±2.70、10.23±1.26。治療后阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組患者各細胞因子水平顯著高于阿德福韋酯組(P<0.05)，見圖3。

圖3 2組患者血清中Th1/Th2細胞因子水平變化*P<0.05，治療后與治療前相比；#P<0.05，阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組與阿德福韋酯相比Fig.3 Changes of serum Th1/Th2 cytokine levels of two group*P<0.05,comparison between pre-treatment and post-treatment;#P<0.05,comparison between Adefovir ester joint Fuzheng Huayu group and Adefovir ester group

3 討論

慢性乙型病毒性肝炎是一種全球性的傳染病，由于病毒的持續復制導致肝臟組織的進行性損傷，最終導致肝硬化、肝癌，嚴重影響患者的生存質量。所以抑制乙肝病毒的治療尤為重要[6-8]。核苷類似物能夠有效的抑制乙肝病毒復制，成為治療乙型肝炎病毒感染的首選。其中的代表藥物阿德福韋酯能在肝臟中轉化為具有活性的二磷酸阿德福韋，從而抑制乙肝病毒的復制。目前已有臨床研究證實阿德福韋酯在治療過程中的變異率顯著低于其他的核苷類似物[9]。故在臨床上廣泛使用。

研究顯示扶正化瘀膠囊可以有效促進二甲基亞硝胺誘導的肝纖維化大鼠肝細胞的修復，降低CCl4造成的急性肝損傷大鼠的血清轉氨酶，提高肝組織超氧化物歧化酶的活性，降低肝臟丙二醛的含量，進而抑制脂質過氧化作用[10-11]。相應的肝組織病理學結果也顯示肝臟損傷顯著減輕，肝細胞呈輕度水樣變，脂肪變性較輕，僅見少數肝細胞呈脂肪變，個別呈氣球樣變，未見顯著的肝細胞壞死及炎細胞浸潤，偶見輕度纖維組織增生，匯管區擴大不顯著。而且，血清ALT、AST水平顯著降低。提示扶正化瘀膠囊能通過抑制肝臟脂質過氧化反應，調節肝內脂肪代謝，從而改善肝細胞炎癥反應，延緩或阻止纖維化的發生或進展，在抗肝損傷方面發揮了極其重要的作用。Cho H[12]發現肝臟組織中存在大量NK細胞，可抑制病毒的復制，這一方面決定于其分泌細胞因子的能力，另一方面還取決于其表面受體的表達情況及活化形式。慢性乙肝患者外周循環中的NK細胞表達顯著減少，NK細胞的表面能夠表達CD244，它是淋巴細胞活化分子家族受體的成員，激活后可以促進IFN-γ大量分泌，乙肝患者中CD244的表達是受抑制的。

本實驗結果顯示：阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊聯合治療慢性乙肝，患者肝臟酶學顯著下降，且治療3個月、6個月后阿德福韋酯+扶正化瘀膠囊組的AST、ALT顯著低于阿德福韋酯組(P<0.05)。但HBV-DNA、HBsAg的變化2組差異并無統計學意義。同時阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊能夠顯著增加CD244 NK細胞的比例，有利于抑制病毒復制。HBV病毒的持續復制能夠招募大量的CD8+T細胞清除病毒，但同時會導致CD4/CD8 T細胞比例失調，而Th1/Th2釋放的細胞因子能夠調節CD4/CD8 T細胞比例。本實驗結果顯示經阿德福韋酯或阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊治療后，患者血清中細胞因子均較治療前顯著增加(P<0.05)。且阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊較單純使用阿德福韋酯增加更為顯著(P<0.05)。這與金劍等[13]的研究結果相吻合，為阿德福韋酯聯合扶正化瘀膠囊在抗乙肝病毒治療過程中的宿主免疫應答研究提供了積極的參考依據。

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(編校：吳茜)

Reseach on host immune response in patients with chronic hepatitis B during antiviral treatment with Adefovir ester and Fuzheng Huayu

ZHANG Yun-tao1, ZHANG Si-xi2, LI Yan1Δ

(1.Tangshan Contagious Hospital, Tangshan 063000, China; 2.The First Hospital of Jilin Univeristy, Changchun 130021, China)

ObjectiveTo investigate the immune response of Adefovir ester combine the Fuzheng Huayu in the process of the treatment of chronic hepatitis B.Methods100 cases with CHB from March 2010 to October 2014 collected in outpatients clinic or hospital were randomly divided into Adefovir ester treatment group and Adefovir ester joint the Fuzheng Huayu treatment group.Levels of AST, ALT, HBsAg and HBV DNA pre-and-post treatment were detected.CD3-CD56+，CD244+NK，CD3+，CD3+CD4+，CD3+CD8+T cells and the contents of CD 4+T cells in serum of two groups were measured by flow cytometry analysis.ResultsThe levels of AST、ALT、HBV-DNA of two group post-treatment were all significantly lower than pre-treatment(P<0.05),and the level of AST and ALT in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group at 3 months and 6 months were obviously lower than Adefovir ester treatment group.HBV-DNA contents between two groups had no significant difference.HbsAg levels of two groups were all significantly increased after 6,9,12 months’treatment (P<0.05),While there was no significant difference between two groups post-treatment.CD3-CD56+cell at 6,9,12 months in two groups were all higher than pre-treatment(P<0.05), which in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group were more higher than Adefovir ester treatment group(P<0.05).CD244+NK,CD3+T cell, CD3+CD4+Tcell at each point post-treatment in peripheral blood of two groups were all increased significantly(P<0.05),which in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group increased more obviously than Adefovir ester treatment group (P<0.05).However, CD3+CD8+cells were reduced obviously after treatment in two groups(P<0.05), which besides 3 month point, its ratio in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group decreased more significantly than Adefovir ester treatment group at other points(P<0.05).Cytokines in serum of two groups were all increased significantly post-treatment(P<0.05), which in Adefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment group were more lower (P<0.05).ConclusionAdefovir ester and Fuzhengh Huayu treatment can improve the situation of AST, ALT, HBV DNA and HBsAg in patients with chronic hepatitis B,promote the expression of NK cells,T cells and Tcell secrited cytokines，and the efficacy is better than Adefovir estertreatment alone.

Chronic hepatitis B; adefovir ester; Fuzhengh Huayu; NK cells; T cells; cytokines

張云濤，女，碩士，副主任醫師，研究方向：傳染病臨床研究，E-mail：15612548855@163.com；李焱，通訊作者，女，碩士，副主任醫師，研究方向：丙型肝炎合并代謝綜合征的臨床分析，E-mail：18331538083@163.com。

R575.2

A

1005-1678(2015)06-0048-05