烏司他丁對氧化損傷腎小管上皮細胞的保護作用研究

溫海濱，覃 勛，蒙如慶，唐峰年，韋 喆，譚 寧

（1.河池市人民醫院腎內科，廣西547000；2.桂林醫學院科學實驗中心，廣西桂林541001）

烏司他丁對氧化損傷腎小管上皮細胞的保護作用研究

溫海濱1，覃 勛1，蒙如慶1，唐峰年1，韋 喆1，譚 寧2

（1.河池市人民醫院腎內科，廣西547000；2.桂林醫學院科學實驗中心，廣西桂林541001）

目的探討烏司他丁對氧化損傷后腎小管上皮細胞的保護作用。方法將腎小管上皮NRK52E細胞隨機分為八組，即N組：正常對照組，H組：500 μmol/L過氧化氫（H2O2），A組：100 U/mL烏司他丁，B組：200 U/mL烏司他丁，C組：400 U/mL烏司他丁，D組：500 μmol/L H2O2、100 U/mL烏司他丁，E組：500 μmol/L H2O2、200 U/mL烏司他丁，F組：500 μmol/L H2O2、400 U/mL烏司他丁。檢測細胞中超氧化物歧化酶（SOD）活力和丙二醛（MDA）含量，觀察細胞氧化損傷情況，以CCK-8法檢測細胞的增殖活性，以流式細胞術檢測細胞凋亡，以反轉錄聚合酶鏈反應檢測Caspase-3基因的表達。結果H組細胞凋亡率明顯高于N、A、B、C組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；E、F組凋亡率明顯低于H組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；H組SOD活力較其他各組明顯降低，MDA含量較其他各組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）；與N組比較，H組Caspase-3 mRNA的表達明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與H組比較，A、B組Caspase-3 mRNA的表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。結論烏司他丁能顯著抗氧化，抑制細胞凋亡，烏司他丁預處理對H2O2誘導腎小管上皮細胞氧化應激損傷有保護作用，其作用機制可能與其可下調Caspase-3表達有關。

過氧化氫；創傷和損傷；上皮細胞；腎小管；烏司他丁；氧化應激

急性腎損傷（AKI）是目前臨床住院患者常見并發癥，其中腎小管的缺血再灌注損傷是主要的病理生理表現，腎小管上皮細胞凋亡與氧化應激損傷在AKI病理生理過程中的作用逐漸受到關注[1]。過氧化氫（H2O2）用于建立細胞氧化損傷的應激模型已得到廣泛應用，如應用在血管內皮細胞和心肌細胞[2-3]。烏司他丁是一種新型酶抑制劑，可抑制多種蛋白酶活性、穩定溶酶體膜、清除氧自由基、抑制炎癥介質釋放，可保護危重癥患者的腎功能[4]，但其具體機制尚未明確。本研究利用H2O2刺激腎小管上皮NRK52E細胞，模擬氧化應激損傷模型，以模擬體內缺血再灌注導致大量氧自由基損傷，然后通過觀察烏司他丁對氧化損傷的腎小管上皮細胞的保護作用，初步探討其對腎小管缺血再灌注損傷的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要材料 NRK52E細胞株（中科院上海細胞庫），DMEM培養液、小牛血清（Gibicol公司），CCK-8試劑盒（大連寶生物有限公司），反轉錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）反應體系（Promega公司），超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）試劑盒（南京建成生物科技有限公司），Caspase-3 mRNA引物（上海賽百盛生物技術有限責任公司合成），烏司他丁（廣東天普生化藥物股份有限公司）等。

1.1.2 分組 設空白對照組，參照作者前期實驗[5]及文獻[6]，使用H2O2濃度為500 μmol/L，烏司他丁濃度分別制備為100、200、400 U/mL進行干預。共分為八組，即N組∶正常對照組，H組∶500μmol/LH2O2，A組∶100 U/mL烏司他丁，B組∶200 U/mL烏司他丁，C組∶400 U/mL烏司他丁，D組∶500 μmol/L H2O2、100 U/mL烏司他丁，E組∶500 μmol/L H2O2、200 U/mL烏司他丁，F組∶500 μmol/L H2O2、400 U/mL烏司他丁。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 NRK52E細胞復蘇后置于DMEM培養液（含10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素）中，在37℃、5%CO2培養箱中傳代培養。每2～3天消化傳代。細胞生長至40%～50%時，去培養基，同步18h后加入不同實驗組藥物繼續培養。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性 調整對數生長期的NRK52E細胞以5 000個/孔接種于96孔板，置于CO2培養箱培養24 h，細胞貼壁后，按照單用烏司他丁組（A、B、C組）及烏司他丁干預H2O2組 （D、E、F組）加藥，并繼續培養48 h后加入CCK-8試劑，連續培養2 h后取細胞的離心上清液在450 nm處測吸光度值，并據此繪制生長曲線。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞凋亡率 按細胞凋亡檢測試劑盒說明書的檢測方法操作。按照1.1.2項各實驗組劑量分別給藥，調整細胞為每毫升1×105～1×106后使用流式細胞儀檢測細胞凋亡率，重復實驗3次，用Multicycle DNA軟件分析凋亡細胞。

1.2.4 SOD測定 按照1.1.2項各實驗組劑量分別給藥后按試劑盒說明書操作步驟，將試劑盒內的試劑配制好后使用550 nm、1 cm光徑，雙蒸水調零、比色，計算光密度（OD）值，計算SOD活力。

1.2.5 MDA測定 按照1.1.2項各實驗組劑量分別給藥，MDA與硫代巴比妥酸（TBA）反應生成紅棕色的三甲川（3，5，5-三甲基惡唑-2，4-二酮），其最大吸收波長為532 nm。吸取離心的上清液2 mL（N組加2 mL蒸餾水），加入2mL0.6%TBA溶液，混勻物于沸水浴上反應15min，迅速冷卻后再離心。取上清液測定532 nm的吸光度。計算MDA含量。

1.2.6 RT-PCR檢測Caspase-3 mRNA水平 將N、H、A、B組細胞培養24 h后提取細胞總RNA，RNA以10 μL體系逆轉錄合成cDNA后稀釋30倍。Caspase-3 mRNA引物序列正義鏈∶5′-TGACCGAGGCTACATTCAGATGACACC-3′，反義鏈∶5′-CAAGAGAG TTGGGCTGACCAGAAACAC-3′，擴增產物為365 bp；β-actin擴增產物為243 bp。擴增后產物用瓊脂糖凝膠電泳檢測并與β-action比較，然后計算相對表達水平。

1.3 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件進行數據分析，計量資料以±s表示，并進行方差分析，PCR檢測結果利用凝膠圖像處理系統檢測條帶灰度值。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 細胞增殖情況及生長曲線 A、B、C組細胞增殖情況與N組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1。與N組比較，H組細胞增殖情況變化較大，差異有統計學意義（P＜0.05）；與H組比較，D組細胞增殖情況無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05），E、F組變化較大，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2。說明200、400 U/mL烏司他丁能抑制H2O2的氧化損傷，而100 U/mL作用不明顯。

圖1 不同濃度烏司他丁組對NRK52E細胞生長的影響

圖2 烏司他丁干預H2O2各濃度組對NRK52E細胞生長的影響

2.2 各組細胞凋亡率比較 H組細胞凋亡率 [（66.30± 1.38）%]較N組[（3.41±1.54）%]顯著增高，差異有統計學意義（P＜0.05），而烏司他丁預處理組細胞凋亡率[A組（3.65±2.43）%、B組（3.97±1.23）%、C組（4.04±1.32）%]較N組無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05）。與H組比較，E、F組細胞凋亡率[（31.30±1.56）%、（21.50±1.63）%]降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而D組細胞凋亡率[（66.30±2.37）%]無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）。說明200、400 U/mL烏司他丁均可使H2O2誘導的細胞凋亡率降低，而100 U/mL無明顯影響。

2.3 SOD測定結果 H組SOD活力[（8.73±1.80）U/mL]較N組[（45.63±2.40）U/mL]明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05），而A、B、C組SOD活力[（42.87±2.10）、（40.54 ±2.00）、（40.32±1.90）U/mL]較 N組無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05）。D、E、F組SOD活力[（27.73± 2.10）、（35.62±1.90）、（40.43±2.10）U/mL]較H組明顯升高，差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明烏司他丁對SOD活力無明顯影響，卻能夠拮抗H2O2對SOD活力的影響。

2.4 MDA測定結果 H組MDA含量[（53.42±2.80）nmol/mL]較N組[（8.25±2.30）nmol/mL]明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05），而A、B、C組MDA含量[（8.87±2.10）、（9.04±1.90）、（9.32±1.50）nmol/mL]較N組無明顯變化，差異均無統計學意義（P＞0.05）。D、E、F組MDA含量[（49.73±2.10）、（38.57±1.80）、（30.53±2.00）nmol/mL]較H組明顯降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。說明烏司他丁對MDA含量無明顯影響，但可以拮抗H2O2對MDA含量的影響。

2.5 烏司他丁對Caspase-3 mRNA水平的影響 隨著烏司他丁濃度的增加，Caspase-3 mRNA的表達減少。見圖3。與N組比較，H組Caspase-3 mRNA的表達明顯增高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與H組比較，A、B組Caspase-3 mRNA的表達降低，差異均有統計學意義（P＜0.05）。見圖4。

圖3 不同處理因素下Caspase-3基因PCR擴增產物電泳圖

圖4 不同處理因素下Caspase-3 mRNA表達結果

3 討 論

腎臟缺血再灌注損傷是一種常見的臨床病理生理過程，常導致急性腎功能衰竭。而腎小管上皮細胞損傷是其主要病理特征。

細胞損傷后機體內H2O2能夠大量釋放羥氧自由基（OH-），而且通過脂質過氧化反應等一系列反應導致腎小管上皮細胞結構的損傷[7]。SOD作為內源性氧自由基清除劑的代表之一，對機體起保護作用，其活力高低可在一定程度上反映內源性氧自由基的清除活力；MDA作為膜脂質降解產生的主要代謝產物，常用來反映脂質過氧化后的氧自由基對組織損傷的程度，故檢測SOD及MDA對評估氧化損傷具有重要意義。

烏司他丁是從人尿液中分離純化的蛋白酶抑制劑，屬人體內源性抑炎物質，其前體是肝臟合成的胰蛋白酶抑制劑。有研究發現，烏司他丁對多種酶，如胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等有抑制作用，可抑制多種水解酶的活性、穩定溶酶體膜、抑制炎癥介質的過度釋放及改善微循環和組織灌注[8-9]。有研究證明，烏司他丁對心肌缺血再灌注損傷有保護作用，其機制與清除氧自由基，抑制炎癥介質釋放，以及穩定細胞膜及改善微循環等有關[10-11]。也有研究證明，烏司他丁具有抗心肌缺血再灌注損傷作用，其機制可能是通過下調IL-6和IL-8介導的炎性反應而實現[12]。而烏司他丁保護腎功能的作用機制目前具有多種可能，如與其抗氧化作用、抑制氧自由基生成、清除氧自由基、穩定細胞膜及減輕自由基引起的腎組織損傷和改善細胞能量代謝有關。

本研究觀察到氧化損傷后NRK52E細胞活力明顯下降，而SOD活力減少，MDA增加，證實氧化應激確實參與了缺氧導致的腎小管上皮細胞的損傷。并發現烏司他丁對氧化應激損傷的腎小管上皮細胞也有直接的保護作用，其保護作用可能與烏司他丁通過清除過氧化物代謝、提高細胞抗氧化和抑制其脂質過氧化作用，拮抗H2O2對SOD活力的影響，減輕細胞氧化損傷對缺血再灌注腎小管的損傷，并對腎小管具有保護作用。且其保護效應與其濃度具有一定關系。

以酶原細胞形式存在于正常細胞質中的Caspase-3，在凋亡早期即被激活，而活化后的Caspase-3以級聯方式逐級放大激活procaspase-2、procaspase-6、procaspase-8、procaspase-10的凋亡信號，從而誘導細胞凋亡[13]。本研究發現，H2O2誘導的NRK52E細胞的氧化應激損傷主要表現為細胞凋亡，預處理給予烏司他丁培養發現，烏司他丁組與H組比較，可顯著改善細胞凋亡率，提高細胞存活率。并發現烏司他丁使SOD活力增加，MDA含量減低，說明烏司他丁可能通過清除氧自由基發揮抗氧化作用，并通過下調Caspase-3的表達，從而抑制細胞凋亡、減輕細胞損傷。

本研究結果表明，烏司他丁對氧化損傷的腎小管上皮細胞具有保護作用，其機制可能與其清除氧自由基、減輕自由基引起的腎組織損傷和改善細胞能量代謝有關；同時發現，在保護腎小管上皮細胞對抗氧化損傷誘導的細胞凋亡過程中能明顯抑制Caspase-3 mRNA的表達，烏司他丁抑制細胞凋亡的機制可能與抑制下調Caspase-3的表達有關，并通過阻斷細胞的級聯凋亡反應，對缺氧導致的腎缺血再灌注損傷起保護作用。其可能機制能為臨床進一步有效治療AKI提供實驗基礎及靶向治療的科學理論基礎。

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Study on protective effect of ulinastatin on renal tubular epithelial cells oxidative injury

Wen Haibin1，QinXun1，Meng Ruqing1，Tang Fengnian1，Wei Zhe1，Tan Ning2
（1.Hechi Municipal People′s Hospital，Hechi，Guangxi 547000，China；2.Scientific and Experimental Center，Guilin Medical College，Guilin，Guangxi 541001，China）

ObjectiveTo investigate the protective effect and mechanism of ulinastatin on renal tubular epithelial cells oxidative injury.MethodsRenal tubular epithelial cells NRK52E were randomly divided into 8 groups，group N∶normal control group，group H∶500 μmol/L H2O2，group A∶100 U/mL ulinastatin，group B∶200 U/mL ulinastatin，group C∶400 U/mL ulinastatin，group D∶500 μmol/L H2O2+100 U/mL ulinastatin，group E∶500 μmol/L H2O2+200 U/mL ulinastatin and group F∶500 μmol/L H2O2+400 U/mL ulinastatin.The cellular superoxide dismutase（SOD）activity and methane dicarboxylic aldehyde（MDA）level were detected.The cellular oxidative injury situation was observed.The cellular proliferation activity was observed by MTT assay，apop tosis was detected by flow cytometry and the expression of Caspase-3 gene mRNA was detected by RT-PCR.ResultsThe apoptosis rate in the group H was significantly higher that in the group N，A，B and C，the difference was statistically significant（P＜0.05）；the apoptosis rate in the group E and F were significantly lower than those in the group H，the difference was statistically significant（P＜0.05）；compared with the other groups，the activity of SOD decreased obviously，and the content of MDA increased apparently，with statistically significant difference（P＜0.05）；compared with the group H，the expression of Caspase-3 mRNA in group A and B both decreased，with statistically significant difference（P＜0.05）.ConclusionUlinastatin has significant antioxidation effect and inhibits apoptosis.Ulinastatin pretreatment has a protective effect on H2O2-induced oxidative stress injury in renal tubular epithelial cells and its mechanism may be related to down-regulation of Caspase-3 expression.

Hydrogenperoxide；Woundsandinjuries；Epithelialcells；Kidneytubules；Ulinastatin； Oxidativestress

10.3969/j.issn.1009-5519.2015.13.004

：A

：1009-5519（2015）13-1937-03

∶2015-03-21）

∶溫海濱（1976-），男，廣西河池人，碩士研究生，主治醫師，主要從事腎臟疾病相關研究；E-mail∶whbniu@163.com。

∶譚寧（E-mail∶wind146wind@yahoo.com.cn）。