草菇絲氨酸蛋白酶基因在貯藏期表達變化的研究

逯連靜+陳明杰+邢增濤+陳國榮

摘 要：采用不覆膜（control）與覆蓋厚度為12μm、打6孔聚氯乙烯膜（PVC12-6）的方式分別對草菇進行保鮮貯藏，觀察比較其蛋白酶活性，并通過實時熒光定量PCR技術研究草菇在貯藏期絲氨酸蛋白酶（SER）基因表達變化規律。結果表明：（1）control的草菇蛋白酶活性在儲藏前期快速增加，在48h酶活性為3.81U/g·min，72h有所下降，但96h達到高峰，為5.80U/g·min；而PVC12-6的草菇蛋白酶活性在貯藏前期緩慢增加，在96h達到高峰，為2.76U/g·min，隨后快速下降；在貯藏期間，control的草菇蛋白酶活性一直比PVC12-6高。（2）control的絲氨酸蛋白酶基因表達量在48h達到最大，隨后表達量下降較慢，且48h之后的表達量遠高于24h的表達量；而PVC12-6的絲氨酸蛋白酶基因表達量在48h達到最高點后迅速下降，48h后的表達量遠遠低于24h的表達量。

關鍵詞：草菇；實時熒光PCR；絲氨酸蛋白酶；貯藏期

中圖分類號 S63 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2015）08-31-04

Expression of the Serine Protease Gene in Volvariella volvacea during Different Storage Time

Lu Lianjing1 et al.

（1Information Research Institute of Science and Technology，Shanghai Academy of Agricultural Sciences，Shanghai 201403，China）

Abstract：The activity of protease of Volvariella volvacea which were packaged by perforated packaging film were investigated.The expression of the serine protease gene of the samples in different storage time were investigated by real-time quantitative PCR.The results showed that the fruit bodies with non-packaging retainedhighest activity of protease which was 5.80U/g·min at 96h.Another sample reached thehighest activity of protease at 96h.The relative expression of SER gene of all samples exhibited a rapid increase at 48h，then they were continuous decrease.But the rate of decreased expression in control was lower than another sample.This result was coincidence relation with the activity of protease.

Key words：Volvariella volvacea；Real-time quantitative PCR；Perforated packaging film；Storage time

草菇（Volvariella volvacea）不僅含有豐富的營養成分，還有重要的醫療保健作用。草菇屬于典型的熱帶菇，呼吸作用旺盛，采后細胞仍處于活躍狀態，其在低溫貯藏時會出現自溶現象，不能像其他食用菌一樣在低溫冰箱中保存，因此其保鮮技術難度較大。鮮菇采后的生化作用都是在各種酶的作用下進行的，研究發現，對草菇貯藏保鮮影響最大的因素之一是蛋白酶[1]，它可以誘導蛋白質發生降解，使大分子蛋白質降解為小分子蛋白質。菇體的腐爛與蛋白質的降解有關，蛋白酶的活性越高，蛋白質降解越也嚴重，菇體腐爛就越快。而蛋白酶活性與該酶的表達量有一定的關聯，如Burton[2]研究發現，雙孢蘑菇采收后，其衰老過程中氮源的代謝分解主要靠絲氨酸蛋白酶，該酶的表達量升高比酶活的升高提前24h，且兩者具有正相關即表達量越高，酶活也越高。目前國內研究草菇保鮮方法大都采用物理和化學的方法，但未從分子水平深層次進行研究。為此，本試驗通過覆蓋膜并打孔的方式包裝草菇，研究在一定的貯藏期內蛋白酶活性的變化與絲氨酸蛋白酶（SER）基因表達變化規律，從分子水平來探討蛋白酶表達量與酶活性的相關性，以達到調節酶活性的目的，為今后進一步研究草菇保鮮方法提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 草菇（V.volvacea）V23子實體材料來自上海寧郁菌菇有限公司，同批采收，采前不噴水，選擇成熟度、顏色一致，大小均勻，且無病害無損傷的草菇子實體。聚氯乙烯膜PVC12（厚12μm）購于杭州恩希愛化工有限公司。聚丙烯托盤（165mm×45mm）購于上海中央化學有限公司。

1.2 處理方法 取當天采收子實體，每120g左右（10～12個）裝于聚丙烯托盤中，用聚氯乙烯膜包裝，并在膜上（面積165mm×115mm）均勻打6個孔（直徑1.3mm），以不覆膜為對照組（control），放置在15℃無光照的生化培養箱內，每處理每隔24h取3盒，每盒為1個重復。

1.3 試驗方法

1.3.1 蛋白酶活性測定 參照Chavira等的方法[3]。

1.3.2 草菇子實體總RNA的提取與純化 草菇子實體總RNA的提取參照汪虹等[4]的方法進行，用DNase處理去除基因組DNA，然后用DEPC處理的雙蒸水溶解，-70℃保存備用。

1.3.3 草菇子實體總RNA的RT-PCR 草菇子實體cDNA的合成參照汪虹等[4]的方法。

1.3.4 引物設計 根據草菇gpd基因cDNA全長序列（Genbank登錄號：DQ14038）和絲氨酸蛋白酶基因片段序列設計定量引物。

1.3.5 目的片段擴增 采用常規PCR擴增技術，應用表1的引物，進行gpd基因與絲氨酸蛋白酶基因片段的擴增、克隆和測序。

表1 定量PCR引物

[引物＼&堿基數＼&序列＼&Ser-F＼&22＼&5TGCCTTGACCTTTACCTACACC-3＼&Ser-R＼&20＼&5-GCAACACCAAACTGGCTTCC-3＼&god-F＼&21＼&5-GGCTTGATGACCACCGTACAT-3＼&gpd-R＼&24＼&5-GCACCAGTGGAAGATGGAATAATG-3＼&]

1.3.6 制備標準品質粒 構建含gpd基因與SER基因片段的定量PCR標準品質粒，參照汪虹等[4]的方法。

1.3.7 SER基因定量測定 采用雙標準曲線法進行定量，可以忽略目的基因Ser和參照gpd擴增效率的不一致。將SER和gpd重組標準品質粒10倍梯度稀釋后，分別以系列稀釋的質粒為模板進行定量PCR擴增，得到2個基因的標準曲線。以2種處理不同儲藏時間的草菇子實體cDNA 2μL為模板分別進行SER基因和gpd基因的定量擴增，每個樣品設2個重復。另每批設2μL ddH2O作為模板的空白對照。反應條件為95℃、5s，51℃、10s，72℃、15s，共40個循環。

2 結果與分析

2.1 不同處理對草菇子實體蛋白酶活性的影響 如圖1所示，control子實體的酶活性在24h（control子實體在貯藏期腐爛較快，96h后失去實驗意義，因此未采集數據）之后陡然上升，除了在24h與PVC12-6的酶活性沒有明顯差異外，其他貯藏期都存在顯著性差異，且在48h達到了貯藏期的一個小高峰，為3.81U/g·min，隨后72h有所回落，96h又陡然上升到5.80U/g·min。PVC12-6的子實體蛋白酶酶活性在24h之后的貯藏期都明顯低于control，且酶活性上升較慢，只有在96h才達到高峰，僅為2.76U/g·min，隨后都逐漸下降。

圖1 不同處理對草菇子實體蛋白酶活性的影響

2.2 RNA的提取和目的片段的擴增 提取的草菇子實體RNA經DNase處理去除基因組DNA后，瓊脂糖電泳結果表明RNA分子保持完整，以此為模板進行常規PCR擴增目的基因SER和內標基因gpd，瓊脂糖電泳在200bp附近獲得條帶，與預期大小相符（圖2），經測序目的條帶與原始序列同源性為100%。

[M][1][2000bp

1000bp

750bp

500bp

250bp

100bp]

圖2 SER基因片段

2.3 標準曲線的構建 圖3、圖4為梯度稀釋SER質粒的擴增動力學曲線，由Rotor-Gene3000實時熒光定量PCR儀配套軟件自動生成，同時生成標準曲線和回歸方程。從標準曲線（圖3、4）可以看出，起始模板濃度與CT值之間存在良好線性關系，SER基因標準曲線回歸方程為conc=10^（-0.315*CT+10.461），內標基因gpd標準曲線的回歸方程為conc=10^（-0.299*CT+8.930），根據標準曲線回歸方程可以得到未知樣品中目的基因和內標基因起始模板濃度。

圖3 絲氨酸蛋白酶質粒擴增曲線

圖4 絲氨酸蛋白酶質粒構建標準曲線

2.4 不同處理貯藏期SER基因表達 根據標準曲線回歸方程對CT值換算得起始濃度，對目的基因濃度與內標基因濃度比值進行比較，得到2個處理在貯藏期間（0h的SER基因表達量極少，未檢測出，因此從24h開始檢測）草菇子實體中Ser基因表達量變化（表2、3）。結果顯示，2個處理在貯藏期為48h時SER基因表達量都達到一個峰值，之后都持續下降（圖5、6）；control子實體的SER基因表達量在48h之后緩慢下降，且表達量都高于24h的表達量；PVC12-6子實體的SER基因表達量在48h達到1.85之后急速下降，且遠遠低于24h的表達量。

表2 處理中control在不同儲藏期草菇子實體SER基因表達量

[15℃下儲藏時間（h）＼&SER

平均CT值＼&SER

相對濃度＼&gpd

平均CT值＼&gpd

相對濃度＼&相對

含量＼&24＼&24.61＼&523＼&15.12＼&4266＼&1.00＼&48＼&23.54＼&1118＼&16.17＼&2192＼&4.25＼&72＼&23.07＼&1556＼&15.05＼&4445＼&2.92＼&96＼&22.78＼&1909＼&14.34＼&6990＼&2.25＼&]

表3 處理中PVC12-6在不同儲藏期子實體SER基因表達量

[15℃下儲藏

時間（h）＼&SER

平均CT值＼&SER

相對濃度＼&gpd

平均CT值＼&gpd

相對濃度＼&相對

含量＼&24＼&18.32＼&2986＼&15.86＼&6199＼&1.00＼&48＼&17.09＼&7802＼&15.36＼&8764＼&1.85＼&72＼&19.83＼&921＼&16.82＼&3197＼&0.60＼&96＼&18.42＼&2757＼&14.90＼&12007＼&0.48＼&120＼&18.86＼&1959＼&15.07＼&10686＼&0.38＼&144＼&19.80＼&942＼&15.93＼&5921＼&0.33＼&]

圖5 control在不同儲藏期SER基因表達量變化

圖6 PVC12-6在不同儲藏期SER基因表達量變化

3 結論與討論

草菇采后后熟作用較強，會繼續生長并產生孢子，而采后由于不能從培養料中吸取養分，從而只能靠子實體自身的代謝來維持。草菇采后碳代謝的碳源為子實體的甘露醇、海藻糖和一些糖原[5]，而氮代謝的氮源則主要為可溶性蛋白[6]。據報道，可溶性蛋白的降解伴隨著蛋白酶的活性增高，且蛋白酶活性越高菇體腐爛越快，保鮮效果越差。蛋白酶中主要起作用的是絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶[6]，而Burton等[7]研究表明，菇體在采收后，氮源營養代謝起主要作用的為絲氨酸蛋白酶，該酶導致大分子蛋白質降解為小分子蛋白質，從而加速腐爛衰老。

絲氨酸蛋白酶蛋白首先轉錄為酶前體，然后必須被水解，其過程為蛋白酶前體通過細胞膜轉移，然后其前肽被水解掉即可變為有活性的酶[7]。衰老子實體中的絲氨酸蛋白酶位于胞外還是胞內至今還不清楚，但是雙孢菇菌絲中的絲氨酸蛋白酶則位于胞外[8]。因此，絲氨酸蛋白酶的活性升高需要2個條件：一是該酶的基因表達量增大，該酶大量被轉錄翻譯；二是該酶必須經過水解，然后通過細胞膜轉移后變為有活性的酶。若該酶被大量轉錄翻譯但被水解掉的酶前體較少，則該酶活性較低；反之若該酶的基因大量轉錄翻譯且其前體被水解掉，則該酶活性較高。

楊淑云等[1]認為草菇在儲藏過程中蛋白酶活性增強是導致草菇軟腐的原因之一。巫光宏等[9]研究了草菇蛋白酶活性在不同溫度下的變化，表明蛋白酶活性越高，草菇越容易腐爛。草菇采后在室溫下只能放置1～2d，本實驗結果表明，control中的草菇子實體的蛋白酶活性在貯藏期較高，在48h達到了一個小高峰，此時子實體已經出現腐爛衰敗現象，96h后則完全失去食用價值，其酶活性達到了貯藏期內最高。但PVC12-6的草菇子實體的蛋白酶活性在貯藏期內較低，最高峰出現在96h，遠遠低于control酶活性，試驗中PVC12-6的草菇在144h內未出現腐爛現象。此研究與巫光宏等的研究結果相一致。

蛋白酶的活性與該酶的基因表達量息息相關。Crawford研究了雙孢菇采后儲藏期間的絲氨酸蛋白酶的表達，研究表明在剛采后鮮菇中該酶沒有表達，而之后儲藏第1天時被檢測到，且在第2～3天表達量達到峰值。Burton證明了該酶表達量增高后的24h酶活才會升高，在第5天表達量顯著降低但是仍然有高的酶活性[9]。相對高的轉錄和高的翻譯水平證明了該酶在食用菌衰老過程中的代謝起到了至關重要的作用。本試驗定量測定了2個處理組的草菇子實體絲氨酸蛋白酶基因在貯藏期的表達量，結果表明control的SER基因表達量在24h之后一直較高，且遠遠高于24h的表達量，與該組蛋白酶活性呈正相關性；PVC12-6子實體的SER基因表達量在整個貯藏期內較低，在48h出現了小高峰之后急速下降，遠遠低于24h的表達量，這與該組的蛋白酶活性較低呈正相關性；2個處理組的SER基因表達量在48h都存在一個高峰，且蛋白酶活性都在96h存在高峰，此結果與Crawford和Burton研究的結果一致，即酶活性的高峰期（96h）都是在其基因表達量高峰期（48h）1～2d后才出現。

由本次實驗表明，草菇在貯藏期的蛋白酶活性越高其腐爛越快，且在貯藏期的蛋白酶活性變化與該酶的基因表達量呈正相關性，即蛋白酶表達量越高則酶活越高，這為今后從分子水平調控酶基因的表達量方面來研究如何抑制生理性酶活，從而為延緩腐爛、延長保鮮期奠定了基礎。

參考文獻

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[2]Burton K.S.，Partis M.D.，Wood D.A.，et al.Accumulation of serine proteinase in senescent sporophores of the cultivated mushroom，Agaricus bisporus[J].Mycol.Res，1997，101：146–152.

[3]Chavira R.Jr.，Burnett T.J.，Hageman J.H.Assaying proteinases with azocoll.Anal[J].Biochem，1984，136：446-450.

[4]汪虹，陳明杰.草菇冷誘導Cor3基因實時熒光定量PCR標準品質量和標準曲線的構建[J].食用菌學報，2007，15（3）：16-19.

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[6]Burton K.S.，Love M.E.，Smith J.F.Biochemical changes associated with mushroom quality on Agaricus spp[J].Enzyme Microb.Technol.，1993，15：736–741.

[7]Crawford s.Kingsnorth，Daniel C.Eastwood，Kerry S.Burton.Cloning and Postharvest Expression of Serine Proteinase Transcripts in the Cultivated Mushroom Agaricus bisporus[J].Fungal Genetics and Biology，2001，32：135-144.

[8]Burton K.S.，Smith J.F.，Wood D.A.，et al.Mycelial proteinases of the cultivated mushroom Agaricus bisporus[J].Mycol.Res.，1997：1341-1347.

[9]巫光宏，詹福建，錢春梅，等.不同溫度處理對草菇、真姬菇蛋白酶活性變化的影晌[J].華南農業大學學報（自然科學版），2004，25（2）：71-74. （責編：張宏民）