白藜蘆醇對糖尿病腎病大鼠氧化應激反應的影響研究①

張志全，高 輝，劉瑩男，李君實，尹芳革，劉中柱

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003；2.93212部隊，遼寧 普蘭店 116200；3.佳木斯市中心醫院，黑龍江 佳木斯 154002；4.佳木斯市婦幼保健院，黑龍江 佳木斯 154003)

白藜蘆醇對糖尿病腎病大鼠氧化應激反應的影響研究①

張志全1，高 輝2，劉瑩男3，李君實4，尹芳革4，劉中柱1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003；2.93212部隊，遼寧 普蘭店 116200；3.佳木斯市中心醫院，黑龍江 佳木斯 154002；4.佳木斯市婦幼保健院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的:研究白藜蘆醇對實驗用糖尿病腎病大鼠氧化應激指標及血管通透性因子VPF表達的影響。方法：雄性Wistar大鼠，隨機分為正常對照組Ⅰ、糖尿病腎病模型組Ⅱ、白藜蘆醇治療組Ⅲ。Ⅱ組與Ⅲ組動物制備糖尿病腎病模型成功。Ⅲ組進行白藜蘆醇灌胃干預，100mg/kg·d，其他兩組灌胃等量生理鹽水。分別在4w、8w、12w，常規檢測尿蛋白含量，并檢測血糖、血肌酐和尿素氮。在4w、8w、12w取腎臟標本制病理切片，用PAS法制片觀察糖原沉積，用免疫組化法標記VPF表達。在12w末用化學比色對照法檢測氧化應激指標MDA，T-SOD，GSH-PX的表達情況情況。結果：Ⅱ組大鼠血糖、血肌酐、尿素氮和尿蛋白明顯升高(P<0.05)。Ⅱ組腎臟病理組織VPF表達陽性度高于Ⅰ組，Ⅲ組低于Ⅱ組表達；Ⅱ組大鼠血糖、血肌酐、尿素氮和尿蛋白明顯升高；Ⅱ組腎臟病理組織VPF表達陽性度高于Ⅰ組，而Ⅲ組又低于Ⅱ組表達；氧化應激各項指標通過對照比較，Ⅲ組與Ⅱ組比較MDH降低,T-SOD、GSH-px均升高。結論：白藜蘆醇有效降低了糖尿病腎病大鼠血糖、肌酐、尿蛋白等生化指標，并有有效改善了MDH、T-SOD、GSH-px等氧化應激指標，降低了血管通透性因子VPF的表達，起到了腎臟修復作用。

糖尿病腎病；氧化應激；血管通透性因子

糖尿病腎病是糖尿病人群重要代表性的并發癥之一，現已成為終末期腎臟病的第二原因，僅次于各種腎小球腎炎，發病率呈上升勢頭。由于代謝功能失調呈現變化多樣性，所以終末期腎臟病甚至比其他腎臟疾病治療更加困難。糖尿病腎病的發病機制受多種因素影響，氧化應激的作用尤顯突出，因為糖尿病腎病時氧化應激的存在，導致腎臟組織中抗氧化酶裂解氧化，所以抗氧化能力明顯降低。白藜蘆醇一種具有天然生物學活性物質的抗氧化劑,其毒副作用較低,既往有研究表明可改善糖尿病腎病大鼠的氧化損傷并提高抗氧化酶的活性，抑制損傷因子的活性[1～3]，白藜蘆醇可能通過影響氧化應激/NF-kB通路改善糖尿病視網膜病變發展[4]。本試驗研究白藜蘆醇通過多種機制改善糖尿病大鼠體內高血糖、肌酐、尿素氮產生保護治療效應，并探討其通過干預影響糖尿病腎病氧化應激反應而起到對腎臟保護效果。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗選用2月齡，體重(160±20)g，Wistar大鼠60只，均為雄性大鼠(購自長春億斯動物實驗中心)。適應性喂養1周后，隨機進行分組；Ⅰ正常對照組；Ⅱ糖尿病模型組；Ⅲ白藜蘆醇治療組，每組20只。各組大鼠飼養環境一致，飲用水為自來水、飼料和墊料均已消毒。腎病組模型與白藜蘆醇組模型禁食后一次性腹腔注射stz(溶于新鮮配制的0.1mol/L的檸檬酸緩沖液，pH4.5)60mg/mg。靜脈采血測空腹血糖并測尿蛋白值，確定判斷腎病模型建立達到成功。

1.2 實驗方法

1.2.1 腎病模型建立后適應性喂養7d，白藜蘆醇治療組腎病糖尿病模型進行灌胃干預100mg/kg·d，其他兩組灌胃等量生理鹽水。分別在4w、8w、12w采血檢測血肌酐尿素氮，并分別于4w、8w、12w末各取24h尿樣標本測尿蛋白含量。

1.2.2 用化學比色對照法測MDA，T-SOD，GSH-PX，取12w末各模型組4只動物標本，麻醉狀態下行腎臟切除術，制作腎皮質組織勻漿清夜。

1.2.3 HE染色腎臟組織病理觀察，模型組各隨機選4只動物，按4w、8w、12w末以50mg/kg苯巴比妥麻醉切除腎臟術，以觀察各模型組腎小球系膜細胞，血管以及腎小球基底膜厚度和細胞外基質蓄積情況。

1.2.4 PAS檢測觀察腎臟組織糖原類物質。

1.2.5 免疫組織化學分析法鏡下觀察AFP、P53表達。

1.3 統計學方法

2 結果

見表1～3，圖1～3。

表1 4周，8周，12周，各組大鼠血糖，肌酐，尿素氮測定

*與Ⅰ組比較,P<0.05,#與Ⅱ組比較,P<0.05。

表2 尿蛋白，4周，8周，12周測定

*與Ⅰ組比較,P<0.05,#與Ⅱ組比較,P<0.05。

表3 各組模型12周末氧化應激指標

*與Ⅰ組比較,P<0.05,#與Ⅱ組比較,P<0.05。

圖1 模型病理組織HE染色切片鏡下改變

圖2 模型病理組織PAS染色切片鏡下改變

圖3 模型病理組織免疫組織化學標記VPF鏡下表達

3 討論

白藜蘆醇,又稱芪三芬,存在于葡萄、桑椹、花生、虎杖等植物和果實中的多酚化合物，葡萄中含量最高，是一種天然抗氧化劑并具有生物學活性。實驗已證明白藜蘆醇對超氧陰離子有強烈抑制作用，具有羥自由基清除活性和抑制氧化劑的活性，目前研究表明，白藜蘆醇可抑制氧化應激對糖尿病腎病腎臟起保護作用，但其作用機制沒有較權威的深入研究。現有研究結果顯示白藜蘆醇通過保護膜脂從而保護細胞膜而起作用，增強機體抗氧化能力，且其抗氧化效果強于維生素E等微量元素，優點是副作用很小。白藜蘆醇同時又抗炎、抗氧化、抗癌、調血脂，治療心肌缺血等作用。本實驗研究通過建立糖尿病腎病大鼠模型，觀察腎功能和氧化應激個指標變化，對白藜蘆醇減輕糖尿病腎病損傷作用進行探討[5，6]。

糖尿病腎病是糖尿病病人最重要的合并癥之一。隨著生活水平提高、膳食習慣改變在中國發病率呈上升趨勢，目前已成為終末期腎臟病的第二位原因，僅次于各種腎小球腎炎。由于存在復雜多變的代謝功能紊亂，發展到終末期腎臟病往往比其他腎臟疾病治療恢復更加棘手。因此及時防治對于延緩糖尿病腎病的意義巨大。遺傳因素、血流動力學異常、代謝異常、高血壓、活性物質代謝異常都是糖尿病腎病的發病誘因。糖尿病腎病發病可通過腎小球濾過率改變，蛋白尿出現，持續蛋白尿，終末期腎衰改變等不同臨床體征表現。臨床治療依據開展不同病期針對性治療，控制血糖血壓、終末期腎臟替代治療、器官移植[7]。

氧化應激損傷導致腎臟血流動力學異常改變，表現為腎小球高灌注、高濾過、血流量、GFR升高，誘發腎組織局部糖代謝紊亂、非酶糖基化、多元醇通路激活、已糖胺通路代謝異常GBM增厚；細胞外基質蓄積，出現腎小球結節樣病變和微血管玻璃樣改變，并發生腎小球濾過膜蛋白屏障功能嚴重損害。氧化應激直接導致腎臟組織內的不飽和脂肪酸收到ROS攻擊，產生丙二醛導致腎臟細胞膜的各項生理平衡嚴重破壞，生物膜通透性增加，血漿蛋白成分大量透過內皮細胞產生沉淀物，蓄積腎小球基底膜，并使其增厚；紅細胞膜過氧化反應，降低膜的流動性，提高對內皮細胞黏附作用；臟成腎組織細胞線粒體DNA破壞。間接損傷發生于腎小球系膜細胞，如轉錄因子NF-kB和AP-1發生磷酸化后被活化，啟動不同種細胞因子轉錄(內皮素-1、腫瘤壞死因子-a、單核細胞趨化蛋白-1)[8]。

通過本實驗可以看到，糖尿病腎臟模型組MDA值高于正常對照組，白藜蘆醇治療組低于糖尿病腎臟模型組，糖尿病腎病模型組T-SOD、GSH-px低于對照正常組，白藜蘆醇治療組高于糖尿病腎病模型組。糖尿病腎病大鼠模型組存在明顯的氧化應激損傷，白藜蘆醇用藥組，MDA含量降低，T-SOD活力、GSH-px活力上升，明顯改善了應激損傷。

白藜蘆醇治療糖尿病腎病大鼠模型，與未治療組相比，其氧化應激指標明顯改觀，提高T-SOD、GSH-px活性，抑制MDA含量，對腎臟氧自由基代謝起到了積極有效的調節作用，通過鏡下觀察細胞外基質糖原成分顯著下降，達到改善腎內血流動力學、減少蛋白尿排出、抑制系膜細胞、成纖維細胞、巨噬細胞活性；改善濾過膜通透性使內生肌酐清除率下降等作用保護腎臟功能。觀察模型組4w、8w、12w病理組織HE染色下腎小球單位改變，對照組腎小球單位均無特異性改變，腎小球單位完整，境界清楚。腎病模型組4w開始出現腎小球改變，鏡下表現為毛細血管基底膜增厚，系膜細胞增生，簡直細胞體積增大，呈彌漫性系膜增生性改變，到8w、12w鏡下改變更加明顯符合糖尿病腎病病理學特點，較典型改變時可出現出現細動脈玻璃樣變及食酸性空泡樣變。觀察模型組4w、8w、12w大鼠腎臟病理組織PAS法染色下腎小球單位及糖原沉積性改變，如鏡下所示對照組腎小球單位均無特異性改變，腎小球單位完整，境界清楚。很少有免疫球蛋白的沉積。腎病模型組4w開始鏡下出現毛細血管基底膜增厚伴隨連續的顆粒狀沉積分布PAS反應陽性，系膜區呈邊界清楚的顆粒狀沉積，但沉積物強度較弱，系膜增寬(+)，細胞中度增生，到8w末時腎臟病理組織鏡下沉積物強度明顯增高累及小于80%呈階段性分布，到12w末時呈連續性彌漫性分布顆粒沉積面積大于80%。系膜細胞增生和系膜區糖原符合物的沉積也較突出，毛細血管團位于腎小囊內但血管腔變窄，間質細胞體積增大。治療組組織鏡下改變，4w毛細血管基底膜增厚出現非連續性顆粒狀沉積分布，從8w鏡下改變開始到12w鏡下所見，基底膜增厚不明顯，顆粒狀沉積信號較弱可視為陰性表達。白藜蘆醇干預情況顯示，改善了腎小球基底膜的濾過作用，糖原沉積減少，達到了積極良好的干預效果。

由上可見，白藜蘆醇本試驗中糖尿病腎病大鼠模型起到了有效的干預修復效果，血清生化指標、腎功均得到積極改善，通過對氧化應激反應過程中MDA含量降低，T-SOD、GSH-px活力得到提高，免疫組化VPF表達情況改善了腎小球血管濾過功能，綜合各方面實驗結果證實，白藜蘆醇通過有效抑制氧化應激而達到了保護腎臟功能的功效，而對糖尿病腎病聯合多效配伍干預治療也成為未來探索方向。

[1]張青.護理干預對糖尿病腎病患者生活質量的影響[J].黑龍江醫藥科學，2010, 33(2):53

[2]趙芳芳,王季猛,程燦.糖尿病腎病發病機制研究進展[J]. 現代生物醫學進展，2010,10(24):4796-4798

[3]張曉波,姚海濤,楊子安，等. 有機鉻對實驗性糖尿病大鼠胰腺保護作用的觀察[J].黑龍江醫藥科學，2004,27(5)：1-2

[4]張篤貞，王大麗，楊笑天，等.白藜蘆醇對實驗性糖尿病大鼠視網膜氧化應激/NF-κB通路的干預作用[J]. 黑龍江醫藥科學，2014,37(1)：105-107

[5]郜海燕,于震宇,陳杭君,等.白藜蘆醇功能和作用機理研究進展[J].中國食品學報,2006,6(1)：411-416

[6]姜麗，胡明燕.白藜蘆醇的研究進展[J]. 安徽農業科學, 2013,41(19):8427,8436

[7]丁洪成,程長明,廖勇敢.白藜蘆醇對糖尿病大鼠腎臟內氧化應激的影響[J].成都中醫藥大學學報, 2009,32(1):62-65

[8]鄭美玲,樊均明.氧化應激對糖尿病腎病時細胞、細胞外基質及血管通透性的影響機制[J]. 中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(25):4988-4991

張志全(1980～)男，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生。

劉中柱(1964～)男，黑龍江佳木斯人，學士，教授，碩士研究生導師。E-mail:liuzhongzhu64@163.com。

R285.1；R287.1

A

1008-0104(2015)01-0088-03

2014-05-10)