三種藥物對CIA大鼠滑膜細胞凋亡與基因表達的影響①

王建業,張天英，喬曉峰，李長德

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

三種藥物對CIA大鼠滑膜細胞凋亡與基因表達的影響①

王建業,張天英，喬曉峰，李長德

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154003)

目的：通過實驗觀察正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片對CIA大鼠滑膜細胞凋亡與基因表達影響,探討正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片治療作用機理。方法：采用隨機分組，①正常對照組：Wistar大鼠，清潔級，沒有造模12只，喂飼普通飼料，灌胃生理鹽水1mL/100g·d；②類風濕性關節炎模型組( 以下簡稱模型組)：造模成功Wistar大鼠12只，灌胃生理鹽水1mL/100g.d；③正清風痛寧緩釋片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃正清風痛寧緩釋片藥液120mg/100g·d,低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃正清風痛寧緩釋片藥液30mg/100g·d；④白芍總苷膠囊組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液50mg/100g·d,低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液10mg/100g·d；⑤萬通筋骨片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃萬通筋骨片藥液60mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃萬通筋骨片藥液8mg/100g·d，五組給藥48d。結果：正清風痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬通筋骨片高、低劑量組滑膜細胞凋亡的數量上明顯高于造模組，CIA大鼠滑膜細胞造模組高于正清風痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬通筋骨片高、低劑量組組，CIA大鼠滑膜細胞造模組高于正清風痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬通筋骨片高、低劑量組組。結論：正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片對CIA大鼠滑膜細胞可以起到很強的誘導凋亡作用。

正清風痛寧緩釋片； CIA大鼠；細胞凋亡

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis RA)是一種病因未明慢性以炎性滑膜炎為主自身免疫性疾病，類風濕性關節炎病變主要發生在滑膜。類風濕性關節炎病理變化是滑膜襯里細胞增生與間質炎性細胞浸潤及微血管新生和血管翳形成，致使關節中軟骨和骨組織破壞。膠原誘導型關節炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型是研究類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis RA)發病機制實驗動物模型。本實驗比較正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片對CIA大鼠滑膜細胞凋亡與基因表達影響，探索從滑膜細胞凋亡去研究中藥治療類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis RA)機制。類風濕性關節炎病變關節與正常關節對比，早晨僵硬明顯，下午減輕明顯，剛開始活動疼痛較重，活動多時僵硬減輕或消失。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

①藥物：正清風痛寧緩釋片(湖南正清制藥集團股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20010174)主要成分青藤堿 ，具有除濕祛風，通絡活血，止痛消腫；白芍總苷膠囊(寧波立華制藥有限公司，批準文號：國藥準字H20055058)主要成分白芍總甙；萬通筋骨片(通化萬通藥業股份有限公司，批準文號：國藥準字Z20025183)主要成分川烏(制)、草烏(制)、馬錢子(制)等二十五味中藥[3～5]。

②試劑：膠原蛋白II型/Collagen Type II(南京奧多福尼生物科技有限公司，CAS 900734，批號200326)；弗氏不完全佐劑/Freund’s Adjuvant Complete(mpbio公司，批號08642862)；10%中性福爾馬林；EDTA 緩沖液(上海百賽生物技術有限公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(上海前塵生物科技有限公司)。

③實驗動物：Wistar大鼠，清潔級，60只，體重(100±20)g，佳木斯大學實驗動物中心提供。

④儀器設備：奧林巴斯(OLYMPUS)CH-2雙目顯微鏡(上海維翰光電科技有限公司)、TKY-TSH(1600mL)生物組織智能脫水機(湖北泰康醫療設備有限公司)、康龍KL型生物組織組織包埋機(湖北康龍電子科技有限責任公司)、JJQ-P2016A生物組織切片機(武漢俊杰電子有限公司)、QIQIAN/啟前HH-600三用恒溫水箱(上海啟前電子科技有限公司)、整支消毒手動單道可調式移液器(上海榮泰生化工程有限公司)。

1.2 實驗方法[1，2]

1.2.1 類風濕性關節炎大鼠模型建立： Wistar大鼠，清潔級，50只，體重(100±20)g，采用0.1M醋酸溶解膠原蛋白II型/Collagen Type II (2mg/mL,4℃,12h),Wistar大鼠尾根部皮下注射0.2mg膠原蛋白10d模型成功。

1.2.2 實驗分組與正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片給藥：采用隨機分組，①正常對照組：Wistar大鼠，清潔級，沒有造模12只，喂飼普通飼料，灌胃生理鹽水1mL/100g·d；②類風濕性關節炎模型組( 以下簡稱模型組)：造模成功Wistar大鼠12只，灌胃生理鹽水1mL/100g·d；③正清風痛寧緩釋片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃正清風痛寧緩釋片藥液120mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃正清風痛寧緩釋片藥液30mg/100g·d；④白芍總苷膠囊組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液50mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃白芍總苷膠囊藥液10mg/100g·d；⑤萬通筋骨片組：高劑量組：造模成功Wistar大鼠6只每天灌胃萬通筋骨片藥液60mg/100g·d, 低劑量組：造模成功Wistar大鼠6只6只每天灌胃萬通筋骨片藥液8mg/100g·d，五組給藥48d，五個處理Wistar大鼠斷頭處死，膝關節取滑膜組織,放入10%中性福爾馬林液中固定、康龍KL型生物組織組織包埋機石蠟包埋，JJQ-P2016A生物組織切片機切片，Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒原位細胞凋亡檢測和基因表達。

1.2.3 細胞凋亡檢測采用堿性磷酸酶標記法，免疫組織化學檢測基因表達結果。

1.2.4 正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片免疫組織化學檢測p53基因表達結果判定標準，見表1。

表1 正清風痛寧緩釋片等對CIA大鼠滑膜細胞凋亡和基因表達結果判定標準

1.3 統計學方法

2 結果

正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片組CIA大鼠滑膜細胞凋亡和基因表達，見表2。正清風痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬通筋骨片高、低劑量組滑膜細胞凋亡的數量上明顯高于造模組(P<0.05)。基因表達方面,造模組遠遠高于各組(P<0.05)。

表2 正清風痛寧緩釋片等對CIA大鼠滑膜細胞凋亡和基因表達±s)

注：與正常組比較,*P<0.05;與模型組比較,△P<0.05。

3 討論

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis RA)是以炎性滑膜炎病變為主原因不明的自身免疫性疾病，主要在關節滑膜襯里細胞增生與間質炎性細胞浸潤及微血管新生和血管翳形成，致使關節中軟骨和骨組織破壞。

本研究發現正清風痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬通筋骨片高、低劑量組滑膜細胞凋亡的數量上明顯高于造模組。CIA大鼠滑膜細胞造模組高于正清風痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬通筋骨片高、低劑量組組。CIA大鼠滑膜細胞造模組高于正清風痛寧緩釋片高、低劑量組,白芍總苷膠囊高、低劑量組,萬通筋骨片高、低劑量組組。

正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片通過研究可以明顯抑制滑膜細胞增殖和滑膜炎癥細胞浸潤。可以明顯誘導更多的類風濕性關節炎滑膜細胞凋亡。類風濕性關節炎的滑膜細胞凋亡機制復雜，影響調控因素很多，正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片誘導細胞凋亡途徑要從相關蛋白和基因表達去探索。

通過正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片對CIA大鼠滑膜細胞凋亡與基因表達研究，實驗證明正清風痛寧緩釋片與白芍總苷膠囊及萬通筋骨片對CIA大鼠滑膜細胞可以起到很強的誘導凋亡作用，為青藤堿和白芍總甙在臨床上治療類風濕性關節炎提供了實驗和理論依據。

[1]代淑華，江清林，辛華，等. 茶黃素和腦血通口服液治療大鼠動脈粥樣硬化的實驗研究[J]. 安徽醫科大學學報，2013，48(10)：1198-1200

[2]黃展，李春豐，王晶，等. 白頭翁正丁醇提取物對小鼠肝損傷保護研究[J]. 黑龍江醫藥科學，2014，37(2)：57-58

[3]國家藥典委員會中國藥典，一部[s]北京:化學工業出版社，2005，135

[4]傅紹萱.青藤堿的藥理作用Ⅱ[J]．藥學學報，1963，10(11):673

[5]陳惠紅.青藤堿制劑的臨床應用及實驗研究進展[J]．實用中醫藥雜志，2006，22(5):317

黑龍江省衛生廳科研項目，編號：2012-215。

王建業(1969～)男，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任醫師，碩士研究生導師。

張天英(1971～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，副主任藥師。E-mail:zty-000@163.com。

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1008-0104(2015)01-0076-02

2014-11-12)