液相色譜質譜方法對前列腺癌患者治療前后血清中代謝組學的研究①

辛 華，江清林，王 莉，馬 雷，王 琳，于海東，劉麗秋，劉君星，牟洪香

(1.佳木斯大學附屬第一醫院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

液相色譜質譜方法對前列腺癌患者治療前后血清中代謝組學的研究①

辛 華1，江清林2，王 莉1，馬 雷1，王 琳1，于海東1，劉麗秋1，劉君星2，牟洪香1

(1.佳木斯大學附屬第一醫院檢驗科，黑龍江 佳木斯 154003；2.佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的：觀察前列腺癌患者治療過程中代謝物的變化，找尋其與前列腺癌患者治療的關系，從而為前列腺癌的早期診斷和發病機制研究提供一個新的思路。方法：超高效液相色譜單級四級桿飛行時間串聯質譜聯用儀分別對臨床四組受試者血清標本進行分析。結果：與正常組比較，前列腺癌未治療組標志物分布有顯著性差異(P<0.05)；前列腺癌治療好組標志物分布有顯著性差異(P<0.05)；前列腺癌治療差組標志物分布有顯著性差異(P<0.05)，兩治療組間標志物分布分布有顯著性差異(P<0.05)。結論：研究發現共同參與了膽固醇代謝的三個有意義的代謝產物(脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸和二十二碳五烯酸)，它們可能在去勢抵抗型前列腺癌轉變中發揮重要作用。

前列腺癌；生物標志物；代謝組學

前列腺癌(prostate cance, PCa)是男性最常見的惡性腫瘤之一[1]。因Pca臨床表現隱匿性和復雜性，早期診斷Pca比較困難，那么建立高效的檢測方法尤為重要，尤其是篩查出血中循環蛋白質類生物標志物[2]。代謝組學是采用高通量化學分析技術，如質譜技術和核磁共振技術并結合化學計量方法對生物體系在給定時間和條件下所有小分子代謝物質的定量分析，從而定量描述生物體內源性代謝物整體代謝變化情況及其對內因和外因應答變化規律的一門新興學科[3,4]。本研究基于液相色譜-質譜聯用的代謝組學方法分析前列腺癌患者血清中內源性代謝物的變化，尋找與前列腺癌相關診斷標志物。在此基礎上觀察前列腺癌患者治療過程中代謝物的變化，找尋其與前列腺癌患者治療的關系，從而為前列腺癌的早期診斷和發病機制研究提供一個新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2013～2014年佳木斯大學附屬第一醫院、佳木斯市中心醫院住院病人36例。其中PCa組12例,年齡52～74歲,平均61歲, 全部經前列腺穿刺病理診斷確診為晚期患者。前列腺癌未治療組(A)12例,年齡57～79歲，平均66歲；前列腺癌治療好組(B)12例, 年齡59～81歲,平均69歲;前列腺癌治療差組(C)12例, 年齡60～82歲,平均70歲;正常對照組(D)選取健康成年男性12例,年齡54～79歲,平均64歲。經腸指檢及前列腺B超檢查正常,排除泌尿系統疾病者。上述受試者年齡、體重均值差異無統計學意義(P>0.05)[5]。

1.2 主要儀器和試劑

超高效液相色譜單級四級桿飛行時間串聯質譜聯用儀及相關配套設備購自美國Waters公司，實驗試劑甲醇，乙腈，甲酸為色譜純級，購自Merck公司；氯苯丙氨酸，購自美國Sigma公司。

1.3 方法

臨床受試者晨起空腹采血，在安靜狀態下，用5mL注射器抽取靜脈血4mL，注入10mL離心管中，室溫靜置30min后，3000rpm離心5min。吸取上清液0.3mL放入凍存管中并做好標記，迅速放入液氮中凍存，后轉入-80℃冰箱中保存待用。上樣分析前使血清在室溫解凍，然后嚴格按照超高效液相色譜單級四級桿飛行時間串聯質譜聯用儀的要求對樣品衍生處理，以供分析。

1.4 統計學處理

采用軟件MassLynxV4.1軟件包提取數據，軟件SIMCA-P software12.0進行PCA分析，結合判別分析及多元統計方法從海量數據中挑選出顯著的代謝標志物。采用Hotelling’S T2檢驗差異性，定義P<0.05為顯著性界值。

2 結果

2.1 臨床受試四組血清中內源性代謝物質的水平

經與數據庫對比前列腺癌組與正常對照組間有差異的可能生物代謝物有L色氨酸、十八酸、尿酸、磷脂醯乙醇胺、a-羥基異戊酸、20-羥基前列腺素F2a、12S-羥二十烷四烯酸、共軛亞油酸、硫酸脫氫表雄酮。前列腺治療好組與治療差組間有差異的可能生物標志物為脫氧膽酸、花生四烯酸、乳糖酸、甘氨鵝脫氧膽酸、甘油磷脂酰膽堿、二十二碳五烯酸、吡啶 、D-半乳糖-1-磷酸、三磷酸脫氧胞苷、脫氧胸苷、齊多夫定磷酸、4a-過氧四氫生物蝶呤、2-羥基二十三烷酸、 前列腺素D2-d4。在上述代謝物中L色氨酸、脫氧膽酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸、吡啶、齊多夫定磷酸、三磷酸脫氧胞苷、甘氨鵝脫氧膽酸的平均水平在腫瘤組與正常對照組間、治療好組與治療差組間的差異有顯著性意義(P<0.05)，且與療效有關見表1。

表1 臨床受試四組血清中8種內源性代謝物質的水平±s)

※前列腺癌各組與正常對照組比較P<0.05；○前列腺癌治療好組與差組比較P<0.05。

3 討論

代謝組學方法篩查生物標志物用于對前列腺癌的早期診斷和療效觀察的作用越來越重要。通過代謝組學方法動態描述癌癥發展過程中代謝物的變化特點，進一步找出可能的生物標志物[6～9]。本研究中，我們探討了可能的代謝生物標志物，其水平在四組臨床受試者血清中的差異有統計學意義。在這些生物標志物中， L色氨酸、脫氧膽酸、花生四烯酸、二十二碳五烯酸、吡啶 、齊多夫定磷酸、三磷酸脫氧胞苷、甘氨鵝脫氧膽酸的平均水平在癌組和正常對照組間顯著不同(P<0.05)，上述物質在血清中水平同治療差組比較，治療好組平均水平更接近于正常對照組，這說明治療好組血清中代謝物的變化與回落接近于正常對照組。

就身體其他器官而言，前列腺腺體內膽固醇水平通常較高，并且已有文獻報道高膽固醇水平與前列腺癌發生相關[10]。我們查閱資料，發現脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸及二十二碳五烯酸共同參與了膽固醇代謝。而我們的研究表明，癌組受試者血清中脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸的水平明顯高于正常對照組。說明由膽固醇衍變來的脫氧膽酸、甘氨鵝脫氧膽酸可能促進了前列腺癌的發生。同治療差組相比，它們在治療好組受試者血清中的水平更接近于正常對照組，說明前列腺癌患者通過治療血清中的代謝物變化再向正常人群接近。因此，脫氧膽酸和甘氨鵝脫氧膽酸可能用于前列腺癌療效的觀察。二十二碳五烯酸是人體必需脂肪酸。一方面可作為抗炎或促炎癥消退物質的前體[11]。而其另一重要功能是膽固醇的運輸和氧化，從而能降低血清膽固醇水平[12]。眾所周知，高膽固醇血癥可以減少腫瘤細胞凋亡，促進腫瘤血管生成及腫瘤細胞增殖[13,14]。在本研究中，二十二碳五烯酸在癌癥未治療組、治療差組與正常組間存在統計學差異，治療好與差組比較存在明顯的統計學差異，而與正常組比較無統計學意義，其值更接近正常組，由此可見，二十二碳五烯酸可能是癌癥治療的潛在靶標。

癌癥在生長中新陳代謝旺盛，其中色氨酸是其生長過程中必不可少的物質，由表1可見治療好組的水平更接近于正常對照組。另外花生四烯酸、吡啶 、齊多夫定磷酸和三磷酸脫氧胞苷是癌癥代謝中產生的物質，尤其在治療差組中的水平更高，因此對于監測療效具有意義。今后需進一步擴大標本數，為前列腺癌的治療以及療效觀察篩查更有意義的可能生物性標志物。

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黑龍江省衛生廳科研課題，編號：2011-398。

辛華(1970～)女，黑龍江佳木斯人，碩士，主任技師,碩士研究生導師。

江清林(1964～)男，黑龍江林口人，碩士，研究員，碩士研究生導師。E-mail:hljyykx@163.com。

R737.25

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1008-0104(2015)01-0074-02

2014-12-12)