血紅素氧合酶-1對大鼠肝臟缺血再灌注NF-κB p65和細胞凋亡的影響

呂颯美，吳友偉，周健，史麗萍

(陜西省人民醫院消化內2科，西安 710068)

·基礎研究·

血紅素氧合酶-1對大鼠肝臟缺血再灌注NF-κB p65和細胞凋亡的影響

呂颯美，吳友偉，周健，史麗萍

(陜西省人民醫院消化內2科，西安 710068)

目的 探討血紅素氧合酶-1(HO-1)對大鼠肝臟缺血再灌注NF-κB P65、細胞凋亡的影響。方法 SD大鼠采用隨機數字表法分成5組：正常組(N)，假手術組(S)，手術組(I/R建立肝臟缺血再灌注損傷模型)，手術給藥Ⅰ組(I/R+hemin)，手術給藥Ⅱ組(I/R+ZnPP)，手術后6 h、 12 h下腔靜脈取血分離血清檢測血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)。Western blot方法測定肝臟NF-κB p65的表達，免疫組化方法測定肝臟Fas蛋白的表達。結果 ①hemin組 ALT、AST較I/R組及ZnPP組明顯降低(P<0.01)；②肝組織NF-κB p65的表達：hemin組NF-κB p65表達比同期I/R組減少(P<0.01)；ZnPP組NF-κB p65表達比同期I/R組增多(P<0.01)； ③肝組織Fas：hemin組Fas表達減少(P<0.05)，ZnPP組Fas表達明顯增多(P<0.01)。結論 HO-1對肝臟缺血/再灌注損傷的保護作用與NF-κBP65密切相關，可能通過抑制NF-κB p65的活性來減少細胞凋亡。

肝疾病；再灌注損傷 ;p65亞基NF-κB;氧合酶類;大鼠,sprague-dawley

血紅素氧合酶-1(HO-1)是生物體內催化血紅素分解過程中一種關鍵的限速酶，具有重要的生物作用。近年來發現，其在細胞應激、組織損傷及細胞凋亡的防治中發揮著一定的作用[1]。核因子NF-KB能與多種細胞基因啟動子或增強子序列特定位點發生特異性結合而促進轉錄和表達，與炎癥反應、免疫應答以及細胞的增生、轉化和凋亡等重要的病理生理過程密切相關。國外研究表明[2-3]：NF-κB在某些環境下可以促進細胞的凋亡，本實驗通過建立大鼠肝臟缺血再灌注損傷模型，探討血紅素氧合酶-1對大鼠肝臟缺血再灌注NF-κBP65、細胞凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 實驗動物：選用西安交通大學醫學部動物實驗中心提供的SD雄性大鼠54只，體重200～275 g，合格證號：SCXK(陜)2007-002。主要試劑：Hemin Znpp均購于美國Sigma公司；兔抗大鼠Caspase-3多克隆抗體及DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 缺血再灌注模型建立 大鼠禁食12 h后，氯胺酮80 mg/kg腹腔內注射麻醉。

建立原位肝I/R模型：取上腹正中切口，入腹后分離肝十二指腸韌帶，充分顯露第一肝門部， 用無損傷血管夾夾閉肝中葉和左外側葉的肝動脈、門靜脈， 以造成70%的肝臟缺血模型，但不阻斷肝右葉、尾狀葉血流，以防胃腸道淤血及再灌注后腸道內的細菌和內毒素回流入肝臟對實驗結果造成的不良影響。當缺血30 min后，松開血管夾，恢復缺血肝葉的入肝血流。N組僅剖腹取血及肝組織，S組入腹后只游離肝門血管，不阻斷肝門血供，于術后第6、12 小時取血及肝組織；I/R組及I/R+hemin組、I/R+ZnPP組均進行I/R手術，并分別再灌注后第6、12小時處死動物，取血、切取肝左葉組織，分別用于各項指標測定、組織學檢查。

1．3 實驗分組 采用隨機數字表法將實驗動物分為5組。⑴正常組(N)6只；⑵假手術組(S)12只；⑶手術組(I/R)：12只，游離肝門血管，分清供應肝左葉和中葉的肝動脈和門靜脈，肝臟缺血30 min，再灌注6 h和12 h；⑷手術給藥Ⅰ組(I/R+hemin)：12只，術前24 h、12 h大鼠腹腔注射hemin(氯鐵血紅素)，每次30 μmol/kg體重，余同手術組；⑸手術給藥Ⅱ組(I/R+ZnPP)：12只術前24 h、12 h大鼠腹腔注射ZAPP，每次10 μmol/kg體重；其余各組予等量生理鹽水腹腔注射。其中S組、I/R組、I/R+hemin組和I/R+ZnPP組再各分為缺血再灌注后6 h及12 h兩個亞組。

1．4 觀察項目 ①血清肝臟酶學指標檢測：手術后6 h、 12 h下腔靜脈取血分離血清用全自動生化分析儀檢測血清谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)。②Western Blot方法測定肝臟NF-κBp65的表達。③免疫組化染色檢測肝組織Fas蛋白的表達，以細胞漿內呈現黃褐色顆粒為陽性細胞，用Motic Med 6.0醫學病理圖像分析系統對圖象進行采集和分析。灰度值數值越小，表明陽性表達越多。

1.5 統計學處理 采用SPSS15.0軟件進行統計學分析，各組間比較進行單因素方差分析(One-way ANOVA)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2．1 血清ALT、AST檢測結果 肝臟缺血再灌注后I/R組與S組相比，術后6 h和12 h時血清ALT、AST明顯增高(P<0.01)，術前給予hemin，則在再灌注6 h、12 h時，血清ALT、AST均比同期I/R組血清ALT、AST水平降低(P<0.01)，術前給予ZnPP，則在再灌注6 h、12 h時，血清ALT、AST均比同期I/R組血清ALT、AST水平增高(P<0.01)，見表1。

2.2 各組大鼠肝組織Fas蛋白免疫組化染色結果 肝臟缺血再灌注后6 h、12 h時，I/R+hemin組與同期I/R組比較，發現I/R+hemin組Fas表達減少(P<0.01)，I/R+ZnPP組與同期I/R組比較，發現I/R+ ZnPP組Fas表達增多(P<0.05)，見表1，圖1。

表1 各組6 h、12 h測定結果對比

注：與正常組比較，aP<0.01；與假手術組比較，bP<0.01；與I/R比較，cP<0.01,dP<0.05

2．3 各組大鼠肝組織NF-κB P65 Western plot測定結果 I/R組和S組、N組比較，在再灌注6 h、12 h時，肝組織NF-κB p65表達明顯增高(P<0.01)；與I/R+hemin組比較，發現再灌注6 h、12 h時，I/R+hemin組的NF-κB p65的表達明顯低于同期I/R組(P<0.01)，I/R+ZnPP組的NF-κB p65的表達明顯高于同期I/R組(P<0.01)，見表1，圖2。

3 討論

HO-1作為亞鐵血紅素代謝的關鍵酶，不僅能催化血紅素生成一氧化碳、自由鐵和膽綠素，而且具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、調節微循環的作用，抗凋亡的作用也成為研究熱點[4]。血清ALT、AST是反應肝臟損傷的重要酶學指標。本實驗中，I/R組血清ALT、AST活性顯著升高，提示缺血再灌注后肝臟發生明顯組織病理損傷，hemin組，在再灌注6 h、12 h時，血清ALT、AST均比同期I/R組水平降低(P<0.01)，ZnPP組，則在再灌注6 h、12 h時，血清ALT、AST均比同期I/R組血清ALT、AST水平增高(P<0.01)，說明HO-l對缺血再灌注后肝組織損傷具有保護作用。這種保護作用究竟通過什么機制而來，很多學者認為NF-κB起了關鍵作用。NF-κB可能是啟動Fas及Fas配體等促凋亡基因表達的重要轉錄因子，肝臟缺血再灌注過程中NF-κB活化可以調節凋亡最重要相關基因的表達，可能引起凋亡基因表達上升、抑凋亡基因表達下降，最終導致細胞凋亡[5]。

Ben-Ari等[6]發現誘導HO-1，對肝臟I/R有保護作用，NF-κB的抑制蛋白IκBa增多，NF-κB表達減少，肝細胞凋亡減少。本研究通過建立肝臟I/R模型觀察NF-κB變化，也取得相類似的結果，發現在再灌注6 h、12 h時，I/R組肝組織NF-κB p65的表達較N組、S組明顯增高，說明肝臟缺血再灌注時NF-κB的活性增高，通過NF-κB的活化上調致炎性細胞因子的表達，導致肝臟的損害，同時發現HO-1高表達時NF-κB p65表達減少，Fas蛋白表達降低，而抑制HO-1表達時NF-κB p65表達增高，Fas蛋白表達增高，推測HO-1可以減少細胞凋亡，可能通過抑制NF-κB p65的活性，減少細胞通過Fas/FasL通路發生凋亡，從而達到減輕肝臟缺血再灌注損傷的作用。

HO-1的肝臟保護作用可能與抑制NF-κB p65的活性有關，但HO-1通過何種途徑抑制NF-κB p65的活性，是否是因為NF-κB的抑制蛋白IκBa的增加，還是通過其他的機制，并不十分清楚，尚有待于進一步研究。

(本文圖1,2見插圖5-2)

[1] Wu BJ,Chen K,Barter PJ,et al.Niacin inhibits vascular inflammation via the induction of heme Oxygenase-1[J].Circulation,2012,125(1):150-158.

[2] Sass G,Barikbin R,Tiegs G.The multiple functions of heme oxygenase-1 in the liver[J].Z Gastroenterol,2012，50(1):34-40.

[3] Karin M.NF-kappaB and cancer: mechanisms and targets[J].Mol Carcinog，2006.45(6): 355-361.

[4] Choi BM,Lim DW，Lee JA，et al.Luteolin suppresses cisplatin induced apoptosis in auditory cells：possible mediation through induction of heme oxygenase-1 expression[J].J Med Food，2008,11(2)：230-236.

[5] Gutierrez SH,Kuri MR,del CER.Cardiac role of the transcription factor NF-kappaB[J].Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets,2008,8(2): 153-160.

[6] Ben-Ari Z,Issan Y,Katz Y，et al.Induction of heme oxygenase-1 protects mouse liver from apoptotic ischemia/reperfusion injury[J].Apoptosis,2013,18(5):547-555.

Effects of heme oxygenase-1 on NF-κB p65 and apoptosis in rats during the liver ischemia /reperfusiondamage

LvSaimei，WuYouwei，ZhouJian，ShiLiping

(DepartmentofDigestionⅡ，ShanxiProvincialPeople′sHospital，Xi′an710068，China)

Objective To explore the effects of Heme Oxygenase-1 on NF-κB P65 and apoptosis in rats during the liver ischemia/eperfusion damage.Methods SD rats were randomly divided into five groups：normal control group，sham group，I/R group， I/R+hemin group，and I/R+ZnPP group.Blood samples were collected from the postcava at 6h and12h after the operation，and the serum was isolated to measure alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST).The expressions of NF-κBp65 and Fas protein in livers of rats were examined by western blot and immunohistochemistry.Results ①The levels of ALT and AST were significantly lower in hemin group than those in I/R group and ZnPP group(P<0.01).②The expression of NF-κB p65 was lower in hemin group than those in I/R group(P<0.01);the expression of NF-κB p65 was higher in ZnPP group than those in I/R group (P<0.05).③The expression of Fas protein was markedly increased in ZnPP group than those in hemin group(P<0.01).Conclusion Protective effects of HO-1 against hepatic ischemia/reperfusion damage were closely related to the reduced NF-κB P65 expression,which maybe decreased the apoptosis via inhibit activity of NF-κBp65.

Liver diseases;Reperfusion injury;NF-kappa B p65 subunit;Oxygenases;Rats,sprague-dawley

呂颯美，副主任醫師,Email：daodao2002@126.com

R575

A

10.3969/J.issn.1672-6790.2015.05.018

2015-05-07)