Apelin-13通過ERK1／2信號通路促進MCF-7細胞的增殖及侵襲

彭雪微，孫麗麗，霍洪亮

（東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024）

Apelin-13通過ERK1／2信號通路促進MCF-7細胞的增殖及侵襲

彭雪微，孫麗麗，霍洪亮

（東北師范大學生命科學學院，吉林長春130024）

采用MTT、Brdu流式細胞術，Transwell侵襲實驗，ElISA、Western blot檢測實驗研究了apelin-13對乳腺癌MCF-7細胞增殖、侵襲的影響.結果表明：apelin-13能夠激活ERK1／2信號傳導通路，上調Cyclin D1和MMP-1的表達，進而促進MCF-7細胞的增殖及侵襲，可為臨床乳腺癌的診斷、防治及愈后評估提供新的思路和方法.

apelin-13；細胞外信號調節激酶1／2；細胞周期蛋白D1；基質金屬蛋白酶1

1998年，Tatemoto等人［1］首次在牛胃分泌物中提取出G蛋白偶聯受體APJ（putative receptor protein related to ATJ）的內源性配體，命名為apelin.迄今的研究表明，apelin是APJ唯一的天然配體.前體含77個氨基酸，可被ACE2水解成多種亞型：apelin-12，apelin-13，apelin-17，apelin-28，apelin-31，apelin-36.研究發現apelin在小鼠的肺、子宮、睪丸的主要存在形式是apelin-36，乳腺中則是apelin-13.另有研究表明，apelin與多種癌癥有密切關系，能夠促進癌細胞的發生、增殖、轉移；apelin還可以促進癌組織中血管新生，從而加速癌細胞的增殖及轉移；apelin在人的乳腺癌組織中含量高于正常組織［2］.目前apelin在乳腺癌中的作用機制仍不是十分清楚.細胞的各種生理生化反應均受到相關細胞因子的調控［3］，因此，本文重點研究了外源性apelin-13對乳腺癌MCF-7細胞的作用及其分子機制.

細胞周期蛋白cyclin D1調控細胞周期由G1期向S期過渡，cyclin D1過度表達與癌細胞增殖密切相關［4－6］.研究發現，在正常生理狀態下，細胞進入S期后，cychin D1會迅速分解.細胞發生癌變時，cyclin D1蛋白高表達，使細胞周期的G1期縮短，提前進入S期，細胞異常增殖.因此，cyclin D1可能在乳腺癌發生及細胞增殖過程中起到了重要的調控作用.

基質金屬蛋白酶1（metal matric proteinase，MMP-1）是一種間質膠原酶，可以特異性降解Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型膠原蛋白，破壞基底膜促進腫瘤的發生、發展.正常情況下，MMP-1的表達量很低，但是當受到佛波醇酯類、生長因子、炎性因子等刺激時，表達量顯著升高.有研究表明，MMP-1在晚期乳腺癌組織中高表達，可作為預測侵潤性腫瘤的標志分子［7］，抑制MMP-1的表達可明顯阻礙乳腺癌細胞的侵襲及轉移［8］.因此，MMP-1已成為研究乳腺癌侵襲及轉移的重要靶點.

絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）是真核細胞內重要的信號傳遞途徑.在哺乳動物體內共鑒定出4個MAPK亞家族，包括：C-Jun N末端激酶、應激活化蛋白激酶JNKs／SAPKs、細胞外信號調節蛋白激酶ERKs以及P38MAPK，他們之間的氨基酸序列同源性大于40%［9］.其中ERK（extracellular signal-regulated kinase）信號轉導途徑被認為是經典的MAPK信號轉導途徑.ERK在多種惡性腫瘤組織中均出現異常表達或活性增強［10－11］.因此，研究ERK信號通路與乳腺癌的關系具有十分重要的意義.

1 材料方法

1.1 試劑

DMEM培養基（美國GIBCO公司）；MTT，Tris，甘氨酸，SDS，apelin-13，ERK抑制劑PD98059（美國Sigma公司）；單克隆抗兔Phospho-p44／42ERK1／2抗體（美國Cell Signaling Technology公司）；單克隆抗體鼠β-肌動蛋白和ECL蛋白印跡試劑盒（美國Santa Cruz公司）；冰醋酸、胰蛋白酶、甘油、蛋白酶抑制劑PMSF、β-巰基乙醇、溴酚藍、二甲基亞砜（DMSO）和結晶紫（北京鼎國生物公司），青霉素-鏈霉素溶液-雙抗（中國碧云天公司）；DEPC水、反轉錄PCR試劑盒、Trizol裂解液（大連寶生物公司）；人MMP-1和CyclinD1ELISA試劑盒（美國RD公司）；Transwell侵襲小室（美國Corning公司）；Brdu細胞增殖檢測試劑盒（北京中昊生物科技有限公司）；脫脂奶粉、溴化乙啶EB（長春尚寶生物公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒；PVDF膜（Millipore公司）.

1.2 MTT法細胞增殖檢測

將200μL生長狀態良好的乳腺癌MCF-7細胞（1×104個）接種到96孔板中，加含10%胎牛血清的DMEM培養基培養12h；小心吸棄上清，按180μL／孔加入新鮮無血清培養基饑餓12h；加apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）刺激細胞24h或10μmol／L apelin-13和10μmol／L PD98059抑制劑；再分別向每孔加入20μL MTT溶液（終質量濃度為0.5mg／mL），繼續孵育4h；小心吸棄上清，每孔加DMSO 150μL，震蕩10min，使孔中殘留的MTT-甲臜結晶充分溶解，采用終點法酶標儀檢測D（490）值.每組實驗5次重復，以保證實驗數據的準確性.

1.3 Brdu流式細胞術

將2mL生長狀態良好的MCF-7細胞（1×106個）接種到6孔板中，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基培養24h；小心吸棄上清，按2mL／孔加入新鮮無血清培養基饑餓12h；apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）刺激細胞12h，根據Brdu細胞增殖檢測試劑盒說明使用流式細胞儀檢測細胞增殖率.

1.4 Transwell侵襲實驗

將MCF-7細胞撤血清饑餓12h，用胰蛋白酶消化細胞，制備細胞懸液，以2×105個／mL的濃度接種于含有apelin-13（0.01，0.1，10μmol／L）或apelin-13和PD98059（均為10μmol／L）底部鋪有基質膠的Transwell上室（小孔直徑8.0μm），24孔板下室中加入含有10%胎牛血清的培養基，在37℃、含5% CO2的培養箱中培養12h.用棉球擦除聚碳酸酯膜的上部細胞，用10%甲醇溶液固定聚碳酸酯膜下部的細胞30s，之后用0.1%結晶紫室溫染色20min.將內置小室正置于載玻片上，倒置顯微鏡下隨機選取3個視野顯微拍照.按0.1mL／孔加入33%醋酸脫色，震蕩，使用酶標儀檢測D（570）值.

1.5 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）

收集細胞培養上清液或裂解液，3 000r／min離心10min，取上清液，－20℃保存備用；從4℃冰箱中取出ELISA試劑盒室溫平衡20min，37℃水浴鍋中加熱溶解試劑盒中的濃縮洗滌液，并用蒸餾水按照1∶20的比例（體積比）稀釋；設置標準品孔和樣本孔，向包被待測抗體的微孔中一次加入樣本、標準品、辣根過氧化物酶標記的檢測抗體；封口膜封口，37℃溫浴1h；用洗滌液洗滌5次，1min／次；徹底洗滌之后加入TMB，37℃避光溫浴15min顯色（TMB能夠在過氧化物酶的作用下變成藍色、在酸的作用下轉變成最后的黃色），顏色的深淺和樣品中的蛋白量呈正相關.加入終止液之后在酶標儀上使用終點法檢測D（450）值.根據標準品的濃度梯度曲線計算樣品濃度.

1.6 Western blot檢測實驗

將培養的細胞經預冷的PBS（0.01mol／L，pH＝7.2～7.3）漂洗2次.吸凈PBS，加入預冷的1mL RIPA裂解液，RIPA裂解液中加入蛋白酶抑制劑PMSF（終濃度1mmol／L）.用細胞刮刮取貼壁細胞，將細胞及裂解液轉移至預冷的離心管中，冰上裂解30min.將超聲探頭沒入混懸液內，超聲破碎2min，破碎分4次進行，每次30s.4℃條件下12 000r／min離心10min.輕輕吸取上清，轉移至新的離心管中，置于冰上，吸取的上清即為提取蛋白；棄沉淀，使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定濃度.為確保每個蛋白樣品上樣量的一致性，－20℃保存備用；測定前，100℃或沸水浴加熱3～5min，以充分變性蛋白.SDSPAGE電泳分離目的蛋白，根據蛋白的相對分子質量標準切割凝膠并將膠上的蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1h.一抗4℃孵育過夜，二抗37℃孵育60min.ECL檢測試劑盒曝光.

1.7 數據分析

實驗數據以平均數±標準差表示，應用Sigma plot10.0軟件統計數據.統計學分析采用樣本平均數t檢驗進行各組間數值的比較，P＜0.05為差異顯著.

2 實驗結果

2.1 Apelin-13促進MCF-7細胞增殖和侵襲

Apelin-13刺激MCF-7細胞24h后檢測D（490）值.結果顯示，隨著apelin-13濃度的升高，D（490）值隨之增大，10μmol／L apelin-13刺激組D（490）值最大（見圖1A）.Brdu標記的細胞增殖實驗結果顯示，與對照組比較，apelin-13刺激組細胞的增殖率明顯提高（見圖1B）.Transwell侵襲小室檢測apelin-13促MCF-7細胞的侵潤作用：用不同濃度的apelin-13刺激MCF-7細胞6h，結晶紫染色.與對照組相比，apelin-13刺激組著色面積明顯升高，且隨著apelin-13濃度的升高著色程度逐漸加深.說明進入小室下室的細胞數量增多（見圖1C）.再收集小室下室的細胞，檢測D（570）值，結果與侵襲小室實驗中各組結果一致，隨著Apelin-13濃度的增加，D（570）值隨之增大（見圖1D）.細胞增殖和侵襲時cyclin D1和MMP-1基因異常活躍.因此，我們用ELISA檢測了apelin-13刺激MCF-7細胞后增殖基因cyclin D1和MMP-1的蛋白表達.結果顯示，cyclin D1和MMP-1的表達與apelin-13濃度呈正相關（見圖1E，F）.

圖1 Apelin-13促進MCF-7細胞增殖和侵襲結果

2.2 ERK1／2信號通路調控apelin-13誘導的細胞增殖和侵襲

為了確定apelin-13促進MCF-7細胞增殖及侵襲所依賴的信號途徑，我們檢測了apelin-13刺激組MCF-7細胞ERK1／2的磷酸化水平.Western blot結果顯示，ERK1／2磷酸化水平與apelin-13刺激濃度呈正相關，10μmol／L apelin-13刺激組ERK1／2磷酸化達到了顯著水平（見圖2A）.apelin-13孵育MCF-7細胞12h后，再用10μmol／L ERK1／2抑制劑PD98059處理MCF-7細胞1h，ERK1／2磷酸化水平明顯降低，表明PD98059能夠阻斷ERK信號通路（見圖2B）.

大量研究表明，ERK1／2調控異常與腫瘤的發生、發展關系密切.上述結果證明，外源性apelin-13能夠激活ERK1／2的表達，apelin-13可能通過激活ERK1／2信號通路促進MCF-7細胞的增殖及侵襲.因此，我們用PD98059預處理MCF-7細胞1h，利用MTT檢測細胞的增殖情況.結果顯示，apelin-13刺激組D（570）值明顯高于對照組，而PD98059處理組D（570）值均有明顯降低，且略低于對照組（見圖2C）.說明apelin-13對MCF-7細胞的促增殖作用被PD98059所抑制.Transwell侵襲實驗結果顯示，apelin-13刺激組結晶紫著色面積明顯高于對照組，侵入到下室的細胞數量增加；PD98059處理后，結晶紫著色面積減少，侵入到下室的細胞數量明顯減少（見圖2D）.ELISA結果顯示，PD98059能夠抑制cyclin D1和MMP-1的表達，使cyclin D1和MMP-1表達與對照組表達量幾乎一致（見圖2E，F）.

圖2 Apelin-13通過ERK1／2信號通路調控MCF-7細胞的增殖及侵襲

3 討論

近年來，大量實驗數據表明內源性配體apelin在人體惡性腫瘤的發生、發展過程中發揮重要的作用.如apelin在人體結腸癌中過量表達，可促進結腸癌的發展［12］.現已發現apelin在乳腺組織和乳汁中含量較高，在人乳腺癌細胞系MCF-7中也有高水平表達.但是，apelin對乳腺癌發生的作用機制還沒有明確結論，為此，我們做了大量實驗檢測外源性apelin-13對乳腺癌細胞MCF-7增殖和侵襲的影響.

不同濃度的apelin-13能夠促進MCF-7細胞的增殖（見圖1A，B）及侵襲（見圖1C，D）.同時，能上調cyclin D1（見圖1E）及MMP-1（見圖1F）的表達且具有濃度依賴性，10μmol／L apelin-13刺激組cyclin D1和MMP-1蛋白表達增加量最為明顯.在細胞周期中，cyclin D1過度表達則會縮短G1期間隔，降低細胞對促細胞分裂劑的依賴性，從而促進腫瘤的發生和發展.MMP-1能夠刺激腫瘤細胞的侵襲和分化，抑制腫瘤細胞的凋亡，從而促進腫瘤的發生和轉移.為了進一步研究apelin-13促進MCF-7增殖及侵襲的分子機制，我們應用ERK1／2抑制劑PD98059，檢測了ERK1／2與apelin-13刺激MCF-7細胞增殖及侵襲的關系.結果表明，PD98059能夠明顯抑制apelin-13誘導的MCF-7細胞增殖和cyclin D1的高水平表達（見圖2C，E）.說明ERK1／2在apelin-13誘導MCF-7細胞增殖周期中起到了重要的調控作用.同樣，PD98059也能夠明顯抑制apelin-13誘導的MCF-7細胞侵襲及MMP-1的表達（見圖2D，F）.Western blot結果進一步證實apelin-13刺激后ERK1／2磷酸化水平升高，apelin-13能夠激活ERK1／2信號傳導通路（見圖A，B）.因此，apelin-13可能是通過激活ERK1／2信號通路促進MCF-7細胞增殖及侵襲的.

綜合以上結果，apelin-13激活ERK1／2作用于相關轉錄因子和蛋白激酶等多種底物進入細胞核，調節cyclin D1，MMP-1等相關基因的轉錄，進而參與MCF-7細胞生長、增殖、侵襲及轉移等多種生理過程，這一機制的闡明可為乳腺癌的治療及預防提供新方向.

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The effect of apelin-13on breast MCF-7cell proliferation and invasion via activate ERK1／2signaling pathways

PENG Xue-wei，SUN Li-li，HUO Hong-liang
（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

This papers researched the effect of apelin-13on breast MCF-7cell proliferation and invasion through MTT，Brdu flow cytometry assay，Transwell assay，Elisa，Western Blot.These results showed that apelin-13could increase cyclin D1and MMP-1and induce MCF-7cells proliferation and migration via activate ERK1／2signaling pathways.

apelin-13；ERK1／2；cyclin D1；MMP-1

Q 253 ［學科代碼］ 180·2130

A

（責任編輯：方 林）

2015-01-27

國家自然科學基金資助項目（51478096）；吉林省重點科技攻關項目（20140204059YY）.

彭雪微（1989—），女，碩士研究生；通訊作者：霍洪亮（1963—），男，博士，副教授，主要從事細胞生理學研究.