靛藍在虹鱒魚體內定位分布的放射自顯影研究

高 鍇，何若竹，檀翠玲，羅彥鶴，閆 佩，Maria E. J?nsson，Ingvar Brandt，周啟星

(1. 天津市環境保護科學研究院 天津300191；2. 南開大學環境科學與工程學院 天津300071；3. 瑞典烏普薩拉大學進化生物學中心環境毒理學系 瑞典SE-75236)

靛藍在虹鱒魚體內定位分布的放射自顯影研究

高 鍇1,2,3，何若竹2，檀翠玲1*，羅彥鶴1，閆 佩1，Maria E. J?nsson3，Ingvar Brandt3，周啟星2

(1. 天津市環境保護科學研究院 天津300191；2. 南開大學環境科學與工程學院 天津300071；3. 瑞典烏普薩拉大學進化生物學中心環境毒理學系 瑞典SE-75236)

以虹鱒魚為實驗魚類，通過水浴實驗，以CYP1誘導劑(PCB126)為研究對象，分析了靛藍在魚全身代謝的動力學情況。通過放射自顯影方法并利用放射性14,C標記的靛藍(18,nM)進行水浴暴露實驗，結果表明：實驗開始20,min后靛藍消化于膽液中；在隨后的實驗中(暴露 3～24,h)，在膽汁的排泄途徑中發現高濃度的標記物。在魚鰓中也存在高濃度的標記物；換水后，其放射性濃度逐漸降低。同時觀察到嗅覺器官中有選擇性的標記，腎臟和肝臟中吸收的放射性物質濃度低于鰓。比較暴露于二甲基亞砜(DMSO)和CYP1誘導物PCB126的魚，其14,C-靛藍總體布局模式相似。CYP1抑制劑玫瑰樹堿可以阻攔14,C-靛藍在魚鰓中的積蓄。

靛藍 放射自顯影 虹鱒魚

靛藍(Indigo)是一類吲哚衍生物，其色素廣泛應用于印染業。據統計，全球每年消耗 50,000,t靛藍用于牛仔面料的生產。[1]靛藍存在兩種氧化還原狀態(見圖1)，一種是中性的且呈深藍色的氧化態，由于酮基與 NH結構中的分子間氫鍵作用而形成的平面形狀的高度穩定結構；[2]另一種是無色的還原狀態(也稱為“白靛藍”)，是染色過程中的一種溶于水的物質。浸泡在白靛藍的面料經風干后，空氣中的氧會將白靛藍氧化成穩定的、深藍色的酮基態。[3]

由于靛藍被認為是一種極為穩定的物質，其在紡織業的廣泛應用對環境造成的影響引起了研究人員的關注。[4]Campos等曾做過調研，認為在牛仔布料的生產加工過程中，白靛藍會隨著廢水被排放到自然界中。[5]另外，日常生活中對經靛藍染色衣物的清洗會使面料褪色，而使靛藍隨污水排放到污水處理廠。由于其溶解性較低，靛藍通常會被吸收在底泥中，但截至目前還沒有相關報道證實這一點。

圖1 靛藍和白靛藍分子結構Fig.1 Molecular structures of indigo and white indigo (leuco form)

雖然目前關于人類對于靛藍的環境暴露問題以及日常生活中皮膚吸收藍色牛仔褲面料中的靛藍狀況等相關信息并不清楚，但是在中醫學領域中，靛藍早已被用于治療各種皮膚病(如牛皮癬等)及慢性粒細胞白血病。[6-8]在治療牛皮癬的研究中發現，青黛(從板藍的莖和葉中提取)和靛玉紅(靛藍異構體)可以抑制表皮生長因子受體(EGFR)的活性、表皮生長因子誘發CDC25B基因表達和人類表皮角質細胞的增殖。[9]

關于靛藍對人類的影響，Adachi等[10]最先在人體內發現了靛藍，通過對非患病人類尿液水解等方法提取了靛藍與其異構體青黛，從而證明人體能通過正常的代謝途徑形成靛藍類物質；此外，還通過基于酵母系統的實驗，證明在人類芳烴受體(AhR)和芳香烴受體核轉運蛋白(ARNT)基因協同表達中，靛藍和靛紅均是芳烴受體(AhR)強力的誘導劑。[10-11]另外，還有研究表明，嚙齒動物通過腹腔內注射或者口腔暴露靛藍后，在肝臟中沒有產生明顯CYP1A1的誘導效果，有可能是由于靛藍的快速代謝造成的。[11-12]

當前，國外開展了靛藍作為內源性 CYP1誘導劑的相關研究，但是靛藍在魚中的吸收、代謝及動力學研究還鮮有報道。鑒于此，本研究選取虹鱒魚為實驗動物，嘗試應用核素顯像手段分析放射性14,C標記的靛藍(14,C-靛藍)在虹鱒魚體內的吸收、組織定位和排出路徑，評價利用14,C-靛藍在檢測CYP1內源性激動劑應用的可行性，為此類化學物的毒理學分析提供依據。

1 原料與方法

1.1 動物與化學物質

虹鱒魚[(68±7),g；(18±1),cm；Mean±SD]購于 N?s fiskod-ling公司(瑞典)，養于烏普薩拉大學進化生物學中心(EBC)水生動物實驗室，水溫保持在 11,°C。3，3’，4，4’，5-五氯聯苯(PCB 126；化學文摘號：57465-28-8)購于Larodan(Malm?，Sweden)；靛藍(CAS：482-89-3)購于 Sigma公司(St Louis，MO，USA)。14,C-靛藍(比活性：55,mCi/mmol；放射化學物純度：98 %,)由 OncoTargeting 公司(Uppsala，Sweden)提供。二甲基亞砜(DMSO)用作PCB126與Indigo的載體溶劑。

1.2 暴露實驗

實驗在透明的聚乙烯袋子(45×90,cm；Gibbon公司，瑞典)中進行。將袋子放在箱子(35×20×19,cm)里后，注入20,L水并持續曝氣。實驗步驟及實驗動物取樣方案如表1所示。在第 1組(實驗對照組)中，7條魚用二甲基亞砜(DMSO，2.5,μg/mL)預處理24,h后，在含14,C-靛藍(18,nM)水體中暴露24,h，在處理 20,min、2,h、6,h、12,h、24,h、24,h＋1,d(換水后)及24,h＋2,d后取樣。第2組的7條魚經PCB126(10,nM)預處理后暴露 24,h后，在含14,C-靛藍(18,nM)水體中暴露 24,h。第3組用于檢驗14,C-靛藍在魚體內吸收是否受到CYP1抑制劑玫瑰樹堿的影響。和第2組相似，3條經過PCB126預處理的魚在暴露于14,C-靛藍之前，在玫瑰樹堿里暴露30,min。分別在暴露于14,C-靛藍12,h、24,h及24,h＋2,d后取樣。使用乙酸作為溶劑配置玫瑰樹堿溶液母液，加入玫瑰樹堿溶液于水后，形成1,μmol的玫瑰樹堿和10,μg/mL的乙酸溶液，使暴露環境pH值從8.0降至7.8。按Ullberg[13]放線自顯影方法，將所有的魚進行冷凍切片處理；處理前取魚部分(右側)鰓絲、嗅覺器官、腎臟及小腸組織，固定在 10%,的甲醛中，以備進行光學顯微鏡放射自顯影檢測。

1.3 放線自顯影法

實驗動物按表 1所述方案取樣，殺死魚后將其固定在羧甲基纖維素(1%,)水凝膠中，凍結在用干冰(-72,℃)冷卻的己烷中。用超薄切片機進行全身水平切片(20,μm)并放在膠帶表面上(3M 公司，美國)。[13-14]將切片在-20,℃冷凍干燥后，置于X射線膠片上(Agfa Structurix膠片)并保存于-20,℃下，所有切片暴露30,d。

表1 暴露實驗方案與取樣時間Tab.1 Exposure protocols and sampling times

1.4 顯微放線自顯影法

虹鱒魚經14,C-靛藍暴露 12,h后，用含有 1.5%,(v/v)戊二醛和1.5%,(v/v)甲醛的磷酸緩沖液(0.1,M，pH 7.4)固定保存魚的組織(鰓、嗅覺器官、腎臟和小腸)24,h。用 70%,(v/v)乙醇沖洗固定后的組織，于室溫下脫水晾干。用乙醇(96%,)將樣品進一步脫水后，用超薄切片機(2,μm)切片并置于載玻片上(Thermo Scientific公司，德國)。用蒸餾水洗滌后，使用Kodak NTB-2(Kodak公司)乳化顯影后置于2,℃冷藏3個月，用甲苯胺藍進行背景染色。最后用光學顯微鏡進行切片分析(放大100～400倍)。

2 結 果

為了檢驗14,C-靛藍的生理處置是否受 CYP1代謝影響，實驗比較了對照組(第1組)與PCB126處理組(第2組)放射自顯影像圖。結果顯示，在放射性物質的分布上，兩組之間不存在明顯的區別。然而，從整體看來，PCB實驗組比對照組的魚鰓中有更明顯的由14,C-靛藍衍生的放射性物質積累。

由放射自顯影像觀察，14,C-靛藍在水中很快由魚鰓快速吸收后立即從肝臟代謝分泌到膽汁中(20,min，見圖2a)。隨后(2～24,h暴露于14,C-靛藍及換水后1～2,d)，在膽汁和小腸中(見圖2b～2g)出現較高濃度的放射性物質。在整個暴露14,C-靛藍期間，鰓絲中觀察到較高濃度放射性物質積蓄(見圖2a～2e)，但將魚放在淡水中凈化后，標記物濃度逐漸下降(見圖2f～2g)。在 6～12,h時，觀察到在嗅覺器官(見圖2d)與腎臟(可能出現在腎小管，待檢)里有14,C-靛藍衍生的放射性物質吸收和保留。在暴露的前期(20,min)，肝臟與腎臟中的標記物濃度相近；但在隨后的暴露中(24,h，24,h＋1,d，24,h＋2,d)，腎臟中存在的放射性物質比肝臟中明顯。

圖2 暴露于14C-靛藍中虹鱒魚的射線自顯影圖Fig.2 Autoradiograms of rainbow trout exposed to14C-indigo via water

實驗用PCB 126處理組暴露CYP1抑制劑玫瑰樹堿，使14,C-靛藍在鰓中的累積幾乎被完全限制(見圖3)；暴露于玫瑰樹堿的魚中嗅覺器官表皮細胞標記物也減少了。基于半定量的對放線自顯影像圖半定量評估，在膽和腸中的放射性物質似乎沒有受到排泄的影響。

圖3 使用CYP1抑制劑玫瑰樹堿處理后對照圖Fig.3 Autoradiograms showing the head region of PCB 126-treated rainbow trout after 12,h of exposure to14C-indigo in water

3 討 論

細胞色素 P450是一種混合功能氧化酶，這種單氧加氧酶體系(CYP)可以將進入組織的有機或無機物質氧化代謝，因此它在對外源性生物質(exogenous chemicals)的代謝、毒物降解和維持魚類生態平衡上發揮著重要的作用，而且還催化內源性物質(endogenous chemicals)的生物合成、降解。以往大多數研究都集中在CYP1A亞科，是由于CYP1A可以作為一種生物標志物指示外源化合物如多環芳烴(PAHs)、多氯聯苯(PCBs)、多氯代二惡英(PCDDs)和多氯代苯并呋喃(PCDFs)等環境污染物的暴露。[15]此外，相關研究認為 CYP450 一些同工酶的變化與腫瘤、腎上腺增生性疾病、巴金森氏疾病等的發展有關。但是，對于內源性CYP1誘導劑的相關報道并不多見。靛藍作為天然的植物成分，是兼備內、外源性 CYP1誘導劑的性質，深入分析靛藍的體內代謝動力學不僅有利于了解其毒理學機理，而且對探索由其引發的相關疾病的保護策略等有著非常重要的意義。結果顯示，魚鰓可從水環境中快速攝取靛藍，并能以水溶性代謝物形式很快從膽和腸道中代謝消除。魚鰓絲積蓄了高濃度靛藍衍生物，這與研究早期發現的結果一致，即魚鰓作為直接暴露于水環境的組織，與水中存在的14C-靛藍直接接觸，誘導鰓絲中存在的 CYP1酶產生作用；由于首過效應，肝臟對靛藍衍生物的吸收程度亞于鰓，這也解釋了在同一暴露條件下肝臟EROD活性低于鰓。[16]

研究人員利用酶法(β-葡萄糖醛酸酶)或化學方法(硫酸，pH＝2)水解從人類尿液中提取出了靛藍。通過進一步實驗發現，靛藍可以誘導在酵母細胞系統中AhR與ARNT的表達，從而表明靛藍是以共軛形式從人類尿液中排出的。基于本研究的放射自顯影結果，表明靛藍在魚類中的代謝途徑與人類相似。本文開頭所述，靛藍存在兩種氧化還原形態，天然的酮基形式以及無色還原形式；雖然共面的酮基結構是 AhR激動劑，但酚基結構卻很有可能無法激活AhR。目前雖然我們還未能證實靛藍向白色靛藍的生物轉化過程，但 Sugihara[12]此前也提出相似的理論，根據 EROD在人類肝細胞產生短暫的激活反應，提出了靛藍(以及靛紅)在細胞培養過程中會以還原狀態(無色形式)出現。經14,C-靛藍暴露 20,min后，在虹鱒魚膽汁及尿液中觀察到高劑量放射性排泄物很可能是還原型的白靛藍，隨后形成羥基共軛物。作為平面分子和 CYP1A的誘導物，靛藍能夠被 CYP1A羥基化；但是經 CYP1A抑制劑玫瑰樹堿預處理的魚的14,C-靛藍的代謝消除率沒有受到影響。由此可見，盡管14,C-靛藍(18,nmol)可以誘導CYP1A的表達，但由 CYP1A介導的新陳代謝對虹鱒魚靛藍的排泄消除并不起主要作用。

在鰓絲中由能觀察到對放射性快速積累和持久保留，但原因尚不清楚。當考慮靛藍誘導 EROD及 CYP1A表達時間非常短暫，[16-17]靛藍在鰓絲中滯留時間不應該很長。然而，高濃度標記物的積蓄表明是靛藍自身(或者其代謝產物)被束縛在鰓絲上。在顯微放射自顯影實驗中，使用溶劑處理后，結果清晰表明，鰓絲上積蓄的放射性物質不是由活性中間代謝物(共價)與組織不可逆結合后形成的。在這點上，靛藍的性質與另一種 CYP1激動劑苯并[a]芘完全不同，后者經暴露處理后不可逆轉地綁定在二級鰓絲上。[18]經 CYP1強效抑制劑玫瑰樹堿處理后，魚鰓中對靛藍的攝取完全被阻攔，[18]可見鰓對靛藍的攝取是 CYP1誘導依賴性的，表明與 CYP1的結合親和力強但過程可逆。

我們在嗅覺器官上皮細胞也發現了標記物的吸收。雖然有報道稱嗅覺器官上皮細胞(經 PCB126預處理)可以與苯并[a]芘產生不可逆的結合，但在未經 PCB126誘導的魚中卻沒有發現此現象。[18]

4 結 語

本實驗采用放射自顯影技術首次對 CYP1誘導劑靛藍在虹鱒魚體內的吸收、分布、排泄等情況提供了初步的形態學依據。對進一步研究分析 CYP1類誘導劑可能對有機體產生的影響及作用機制提供了科學依據。■

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Autoradiographic Disposition of Indigo in Rainbow Trout

GAO Kai1,2,3，HE Ruozhu2，TAN Cuiling1*，LUO Yanhe1，YAN Pei1，J?NSSON E．Maria3，BRANDT Ingvar3，ZHOU Qixing2
(1．Tianjin Academy of Environmental Sciences，Tianjin 300191，China；2．College of Environmental Science and Engineering，Nankai University，Tianjin 300071，China；3．Environmental Toxicology of Evolutionary Biology Center，Uppsala University，Uppsala SE-752 36，Sweden)

In the study，the whole-body kinetics of indigo in rainbow trout was examined through exposure via ambient water．Determined by autoradiography，there was an uptake of14,C-indigo(18,nM)from the water and a subsequent elimination into the bile within 20,mins．At later time-points(3-24,h of exposure；24,h of exposure plus 1-2days in clean water)，high concentration14C labelled substances were present in the biliary excretory pathways．A high concentration of radioactivity appeared in the gill filaments throughout the exposure period(24,h)，and the concentration gradually decreased when fish were put in clean water for depuration．A selective labelling of the olfactory organ was also observed．The uptake of radioactivity in the kidney and liver was pronounced but lower than in the gills．The overall distribution pattern of14,C-indigo was similar in fish exposed to the vehicle(DMSO)and in fish exposed to the CYP1 inducer，PCB126．The accumulation of14,C-indigo in the gills was，however completely blocked in PCB 126-exposed fish exposed to the CYP1 inhibitor ellipticine.

indigo；autoradiography；rainbow trout

X171.5

A

1006-8945(2015)09-0083-04

*通訊作者

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃(合同編號：14JCYBJC43800)。

2015-08-02