高效液相色譜法在乳制品三聚氰胺含量檢測中的應用淺析

朱曉晨（上海實力可商品檢驗有限公司,上海200231）

高效液相色譜法在乳制品三聚氰胺含量檢測中的應用淺析

朱曉晨
（上海實力可商品檢驗有限公司,上海200231）

摘要：建立一個快速有效的樣品預處理方法，利用高效液相色譜儀，建立一個快速、有效、靈敏、準確并具有非常良好的可重復性的高效液相檢測方法，檢測乳制品中的三聚氰胺的含量。方法：利用HPLC，在240nm的波長處，對乳制品中的三聚氰胺的含量進行檢測。結果：高效液相色譜法檢測乳制品中三聚氰胺的含量的方法有很好的準確度和精確度，而且該方法操作方便、快速。結論：為了保證乳制品的安全可食用，需要準確而快速的對乳制品中的三聚氰胺含量進行檢測。利用高效液相色譜法可以既準確又快速的檢測出乳制品中三聚氰胺的含量，為乳制品的安全保駕護航。

關鍵詞：三聚氰胺；乳制品；高效液相色譜法

0引言

三聚氰胺(melamine)簡稱三胺，為白色晶體粉末。俗稱又為蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺。在水中的溶解度很低，并且其水溶液呈弱堿性，不溶于C2H5OC2H5，C6H6和CCl4。能溶于甲醇、乙腈、乙酸、甲醛等有機溶劑。三聚氰胺能被各種酸酸化，生成三聚氰胺鹽。

在傳統食品工業上，通常采用凱氏定氮法測量蛋白質含量，這種方法的缺陷是只能測出食品中氮的含量，不能測出氮的來源和種類。蛋白質中氮的含量是16%，三聚氰胺中氮的含量是66%，因此三聚氰胺被一些不法商家利用，將其添加進食品中，造成食品含有高蛋白的假象，在乳制品中尤是如此。三聚氰胺被人體吸收后，在人體中發生分解反應，得到產物三聚氰酸，三聚氰胺和三聚氰酸結合形成網狀體，在人體中生成結石，對人體造成危害。

在2007年，美國發生了幾起貓、狗的不明中毒死亡事件，經調查發現，根源是寵物食品中違規添加了三聚氰胺。2008年，我國發生了震驚國人的“毒奶粉”事件，其根本原因是不法商家在患兒使用的奶粉中添加了三聚氰胺。政府部門也在積極應對三聚氰胺食品安全事件，全國的各個食品檢測機構均努力研發各種行之有效的檢測方法，并出臺了各項檢測標準：GB/T22388-2008GB/T22400-2008GB/T22288-2008等。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1?主要儀器

2695/2487含有柱溫箱和紫外檢測器的高效液相色譜儀（美國Waters公司）；TTL-DCⅡ氮吹儀（北京同泰聯科技有限公司）；HI850R高速離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；WIGGENSVortex3000漩渦混合器（北京桑翌實驗儀器研究所）；超聲提取儀（上海比朗儀器制造有限公司）；陽離子交換固相萃取柱（60mg/3mL）（北京華盛譜信儀器有限責任公司）。

1.1.2?主要試劑

三聚氰胺標準品（Sigma公司）；甲醇（色譜級）；乙腈（色譜級）；超純水（色譜級）；氨水（濃度為25%~28%）；三氯乙酸（10g/L）；乙酸鉛溶液（22g/L）。

1.2實驗方法

1.2.1?提取液配制

量取480ml濃度為10g/L三氯乙酸溶液，向其中加入20ml濃度為22g/L的乙酸鉛溶液。

1.2.2?氨化甲醇溶液配制

取5ml氨水用甲醇定容至1L。

1.2.3?流動相的配制

稱量庚烷磺酸鈉2.02g，檸檬酸2.10g，與1L的容量瓶中，用超純水定容至1L。量取900ml該溶液與100ml乙腈混合。

1.2.4?標準貯備液配制

量取200ml甲醇溶液，用超純水稀釋至1000ml，得到20%（v/v）溶液。稱取100mg三聚氰胺標準品于100ml容量瓶中，用配制好的20%（v/v）溶液定容至100ml，終濃度為1mg/ml。儲存在4℃冰箱中，可有效保存3個月。

1.2.5?標準工作液配制

量取適量三聚氰胺貯備液，以20%（v/v）的甲醇溶液將其稀釋為1.0、5.0、10、25、50μg/L，儲存在4℃冰箱中，可有效保存1周。1.2.6?樣品的預處理

將乳制品混勻，然后稱取2.00g于50ml離心管中，加入提取液稀釋至20.0ml，渦旋處理30s，超聲處理20min，然后靜止2min，在在10000rpm離心5min。

1.2.7?凈化

分別量取3ml甲醇和3ml超純水，對混合型離子交換固相萃取柱進行活化。精確量取10.0ml離心上清液，然后分批上柱，將過柱流速穩定在1ml/min。然后用3ml超純水洗滌滌混合型陽離子交換固相萃取柱，接著繼續用3ml甲醇洗滌混合型陽離子交換固相萃取柱，將洗滌液吹干后，再取3ml氨化甲醇洗脫，收集洗脫液，置于氮吹儀上，用50℃氮氣吹干。用移液管取1.0ml200ml/L甲醇溶液將殘留樣品溶解，渦旋1min，用孔徑為0.45μm濾膜過濾，用高效液相色譜法進行測定。

1.2.8色譜條件

色譜柱：C18柱，150*4.6mm，5μm，柱溫30℃，流速1.0ml/ min，進樣量20μL。流動相：見方法。

1.2.9?檢測

以保留時間為準進行定性，試樣的保留時間和標準品的保留時間要小于2%。定量測定采用單點或者多點外標法。乳制品樣品中三聚氰胺的峰面積在標準曲線的范圍內。

1.2.10?工作曲線以及三聚氰胺含量計算

C表示樣品中三聚氰胺的含量，以質量分數表示，單位是毫克每千克（mg/kg），單點校正的公式：C=A*CS*V1*V3*1000/ AS*M*V2*1000；

式中：AS指的是液相色譜峰型的面積；A指的是樣品溶液對應的色譜峰面積；CS指的是三聚氰胺標準品溶液的濃度（μg/ml），V1和V2分別指的是提取液的體積和過柱體積，單位是mL，M是進樣量，單位是g。

2結果

2.1凈化條件的確定

三聚氰胺是堿性物質，因此在該實驗中，使用OasisMCX固相萃取柱凈化，OasisMCX固相萃取柱能有效的留住堿性物質，并能將乳制品樣品中的雜質去除，本實驗中，以低濃度的氨水為洗脫液，可以最大程度上降低萃取柱對堿性樣品中雜質的吸附。盡可能消除雜質對試驗結果的干擾。將5ml氨水用甲醇溶解至100ml得到50ml/L的氨化甲醇溶液，當三聚氰胺通過OasisMCX固相萃取柱后，用氨化甲醇溶液洗脫，三聚氰胺的回收率能達到99%。

2.2液相條件的確定

三聚氰胺屬于極性非常強的有機物，通過反相C18柱時，幾乎沒有保留，為了更好的進行色譜分離，形成有效、清晰的色譜峰，以乙腈和的0.01moL/L庚烷磺酸鈉及檸檬酸離子緩沖液為流動相，調節兩者之間的比例進行試驗（1：9和6：94）以縮短分離時間，增強分離效果。經過比較發現，當比例為6：94時，三聚氰胺在240nm紫外下檢測，呈現較大的吸收峰，分離效果比較理想。

2.3液相方法的分離范圍

配制濃度一定濃度梯度的三聚氰胺標準品溶液，濃度分別為0mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L、0.5mg/L、0.80mg/L、1.00mg/L，利用前述的液相設備和條件，檢測這一系列濃度梯度的三聚氰胺標準品溶液，結果表明，在上述濃度范圍內，三聚氰胺的濃度與色譜峰面積呈現良好的線性關系，規定本實驗的檢測限為0.5mg/kg，定量限為1mg/kg，所以，如果乳制品樣品中的三聚氰胺的含量低于0.5mg/kg，則視為不含三聚氰胺，一旦檢測結果顯示三聚氰胺的含量高于0.5mg/ kg，則視為乳制品中添加了三聚氰胺，需要向質監局報告。

2.4回收率和精度

利用上述色譜條件，對乳制品樣品進行檢測，同時設置空白和平行試驗，平行試驗的量都是1mg/kg，遵照規定的試驗流程進行操作，對樣品進行處理，然后依據上文給出的公式計算三聚氰胺的含量和回收率，結果顯示，該色譜條件的平均回收率分別是為89.9%和90.1%。

2.5該色譜方法的實際應用

2008年9月份和10月份，分別采集某市14家具備一定規模的奶牛養殖基地。以上述建立的色譜方法對采集到的乳制品樣品進行檢測，結果發現，有一家奶牛場生產的乳制品中三聚氰胺的含量為0.587mg/ kg，超出了最低檢測限，然后我們對該樣品進行了10次平行檢測，結果不變，因此可以認為該奶牛場生產的乳制品存在違規添加三聚氰胺的行為，需要報告至質監局。

3結語

乳制品的傳統檢測，采用的是凱氏定氮法，該方法通過檢測氮的含量，來確定乳制品中蛋白質的含量，不法商家利用該漏洞，添加含氮量高的三聚氰胺，以造成蛋白含量高的假象。

利用本文建立的液相色譜方法對乳制品中的三聚氰胺進行檢測，結果表明本文建立的方法具有穩定的凈化效果，且檢測限很低，方法的可重復性好，回收率高且穩定，回收率均在89%以上，檢測方便，具備很強的可操作性。能檢測到含量在檢測限0.5mg/kg以下的乳制品中三聚氰胺的含量，這樣基本上保證了三聚氰胺添加行為不再漏網。

參考文獻：

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