微血管及微淋巴管在鼻咽癌組織中表達情況研究*

江河，司勇鋒，蘭桂萍，翁敬錦，韋海明

(廣西壯族自治區人民醫院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科，廣西南寧 530021）

微血管及微淋巴管在鼻咽癌組織中表達情況研究*

江河，司勇鋒，蘭桂萍，翁敬錦，韋海明

(廣西壯族自治區人民醫院耳鼻咽喉頭頸腫瘤科，廣西南寧 530021）

目的：觀察微血管及微淋巴管在鼻咽癌組織中表達情況。方法：63例中晚期鼻咽癌患者隨機分觀察組和對照組，觀察組32例給予rAd－p53瘤內注射+同步放化療;對照組31例僅給予同步放化療。采用免疫組化二步法檢測兩組患者癌組織中CD34－MVD、D2－40蛋白等，對比分析兩組。結果：在鼻咽癌組織中均能觀察到D2－40蛋白和CD34蛋白表達;觀察組患者治療后鼻咽癌組織D2－40蛋白表達明顯低于治療前，差異有統計學意義(P＜0.01）;對照組患者治療前后D2－40蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05）;觀察組觀察組CD34－MVD的表達較治療前明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.01）;對照組治療前后鼻咽癌組織CD34－MVD的表達無明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05）。結論：D2－40蛋白和CD34蛋白均在鼻咽癌組織中表達，在鼻咽癌發生發展過程中起重要作用。

鼻咽癌;微血管;微淋巴管

鼻咽癌是廣西常見的惡性腫瘤之一，近年發病呈現逐年上升趨勢，嚴重影響患者身體健康。因此，尋找有效的治療方案和判斷預后的生物學指標是目前臨床研究者關注的一個熱點。癌細胞轉移是鼻咽癌基礎研究和臨床治療的熱點和難點，癌細胞如何通過淋巴管和微血管轉移還存在爭議［1，2］。我們通過免疫組化檢測方法了解D2－40蛋白和CD34蛋白均在鼻咽癌組織中表達情況，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料：2007年2月至2010年8月我科收治中晚期鼻咽癌患者63例，其中男52例，女11例，年齡22～6歲，中位年齡42歲。觀察組患者臨床基本資料如性別、年齡、T分期、N分期、臨床分期等與對照組相比較，差異無統計學意義(P＞0.05），見表1。

表1 觀察組與對照組患者臨床基本資料的比較

1.1.1 納入標準：①年齡20～64歲，性別不限;②符合診斷標準，病理診斷為鼻咽部未分化非角化性癌，未使用抗癌藥物治療;③臨床分期Ⅲ、Ⅳ期;④卡氏評分≥70分;⑤自愿參加并簽署知情同意書。

1.1.2 排除標準：①不符合納入標準;②癌細胞遠處轉移;③合并其他嚴重感染者;④研究期間使用其他抗腫瘤藥物進行治療;⑤合并其他嚴重疾病如急性腦卒中、腦出血、精神病患者、肝腎功能嚴重損傷者。

1.1.3 剔除標準：①患者治療依從性差;②患者治療期間出現不良事件，經評估不適合繼續參加研究;③使用rAd－p53出現不耐受的不良反應。

1.2 治療方法

1.2.1 對照組：僅給予同步放化療，其中放射治療操作及劑量為：采用直線加速器對鼻咽部進行常規照射，放射總劑量控制在70～76Gy，放射療程為7～8周，共進行35次放射治療，對于頸部轉移的腫瘤病灶可將放射總劑量控制在60～70Gy。化療操作及劑量：一般采用卡鉑+5－Fu方案。卡鉑劑量500mg/m2，一次給藥，加入5%葡萄糖注射液250mL中靜脈滴注。5－Fu劑量500mg/m2，每天1次，加入5%葡萄糖注射液1000mL中靜脈緩慢滴注，總量5g為一個療程，與放療同步進行，21d后重復化療1次，共2個周期。

1.2.2 觀察組：給予rAd－p53瘤內注射+同步放化療，rAd－p53使用方法：1支(1×1012病毒單位，中國深圳賽百諾公司生產，批號S20080831）使用生理鹽水稀釋2mL后在鼻內鏡直視下進行鼻咽部多點原發病灶瘤體內注射，每周1次，連用8周。放化療與對照組相同。1.3實驗方法

1.3.1 微血管：采用免疫組化Elivision TM plus二步法檢測兩組患者治療前后原發病灶腫瘤組織中的CD34蛋白和微血管MVD計數。檢測所需的試劑盒(由福州邁新生物技術開發有限公司生產）DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術公司生產），CD34蛋白抗體(北京中杉生物技術公司生產）。實驗步驟：經病理確認的標本用4%甲醛固定，然后進行脫水，使用石蠟包埋技術處理，然后切片，采用Elivision TM plus二步法，按照試劑內置的說明書操作進行CD34蛋白檢測。使用已知道的CD34蛋白陽性切片作為陽性對照，使用PBS代替陰性對照，進行切片確認。

1.3.2 淋巴管：試驗試劑：免疫組化ElivisionTM plus二步法試劑盒(由福州邁新生物技術開發有限公司生產），DAB顯色試劑盒(北京中杉生物技術公司生產），D2－40單克隆抗(北京中杉生物技術公司生產）。實驗步驟：經病理確認的標本用4%甲醛固定，然后進行脫水，使用石蠟包埋技術處理，然后切片，采用Elivision TM plus二步法，按照試劑內置的說明書操作進行D2－40蛋白檢測。

1.4 結果判斷

1.4.1 微血管：CD34－MVD：采用Weidner方法，即先在40倍鏡下選擇高血管密度區(熱點區）計數，然后在200倍視野下計數被染成棕黃色的血管數目。

1.4.2 微淋巴管：D2－40陽性表達于淋巴管內皮細胞胞膜和胞質，呈棕黃色顆粒。微淋巴管計數(MLVD）方法采用Weidner法計數：先在低倍鏡下尋找新生脈管最密集的區域即熱點(hotspot），然后在高倍鏡下對淋巴管進行計數，在腫瘤組織內以5個高倍鏡視野脈管的平均數表示微淋巴管(MLVD）。

1.5 隨訪：采用患者定期回院復查和由專門隨訪員電話進行隨訪，隨訪時間從2007年10月至2012年3月，隨訪資料錄入epdata3.1數據庫。

1.6 統計學方法：采用SPSS19.0統計軟件對整理的數據進行統計學分析，計量資料組間的比較采用t檢驗，計數資料組間比較采用χ2檢驗分析，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結果

2.1 D2－40蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況：D2－40標記的淋巴管呈一致性的官腔結構，呈棕黃色染色，表現為一層薄壁，管腔內很少有淋巴細胞，無紅細胞，見圖1。

圖1 D2－40蛋白在鼻咽癌組織中的表達(SP×200）

2.2 CD34蛋白在鼻咽癌組織中的表達情況：CD34標記的微血管可見染色清晰的血管內皮細胞，呈棕黃色至深褐色彌散性分布，官腔大小不一，見圖2。

圖2 CD34蛋白在在鼻咽癌組織中的表達(SP×200）

2.3 兩組患者治療前后D2－40蛋白的表達情況的比較：觀察組患者治療后鼻咽癌組織D2－40蛋白表達明顯低于治療前，差異有統計學意義(P＜0.01）;對照組患者治療前后D2－40蛋白表達無明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05），見表2。

表2 兩組患者治療前后D2－40蛋白的表達情況的比較

2.4 兩組患者治療前后CD34－MVD表達情況的比較：觀察組CD34－MVD的表達較治療前明顯下降，差異有統計學意義(P＜0.01）;對照組治療前后鼻咽癌組織CD34－MVD的表達無明顯變化，差異無統計學意義(P＞0.05）對照組，見表3。

表3 兩組患者治療前后CD34－MVD的表達情況的比較

3 討論

鼻咽癌侵襲轉移是一個復雜有序的過程，期間存在細胞粘附性下調、基質降解和遷移能力增強等多個關鍵環節，同時新生淋巴管和新生微血管提供腫瘤生長所需物質，并通過血液循環和淋巴循環將原發癌細胞輸送到轉移淋巴結和遠處把器官。大量臨床研究表明，鼻咽癌細胞主要通過淋巴系統進行擴散和轉移，目前常見的淋巴管特異性標志物有腎小球足突細胞膜粘蛋白(D2－40）、血管內皮生長因子受體－3(VEGFR－3）等［3～5］。近年來的研究表明，腫瘤的生長和轉移依賴于腫瘤血管生成。微血管密度(MVD）是目前檢測鼻咽癌腫瘤血管形成的一個重要指標，檢測抗CD34抗體標記的微血管密度是判斷腫瘤復發和轉移的有效指標［6］。

本研究結果顯示，D2－40蛋白和CD34蛋白均在鼻咽癌組織中表達，提示我們根據這些指標的變化可以評估鼻咽癌的治療效果。江河等［7］人研究結果示，D2－40與癌組織遠處轉移有關，D2－40蛋白表達降低，MLVD數量下降，遠處轉移風險低。周日晶等［8］人研究結果顯示，鼻咽癌患者CD34蛋白表達降低，MVD數量下降，降低了癌組織向遠處轉移的風險。研究也顯示，在治療前后的比較研究中，觀察組患者D2－40蛋白表達下降明顯，而對照組無明顯變化，提示我們rAd－p53瘤內注射+同步放化療效果明顯優于單純同步放化療，觀察組患者D2－40蛋白表達低，說明該治療方案能明顯抑制癌組織淋巴內皮細胞和淋巴管生成。另外，研究結果也顯示，觀察組CD34－MVD的表達較治療前明顯下降，而對照組CD34－MVD的表達治療前后無明顯下降。提示我們rAd－p53瘤內注射+同步放化療方案不僅能抑制淋巴內皮細胞及淋巴管生成，同時也能抑制癌組織微血管的形成，研究文獻亦證實本研究結果。

［1］Beddy D，Hyland JM，Winter DC，et al.A simplified tumor regression grade correlates with survival in locally advanced rectal carcinoma treated with neoadjuvant chemoradiotherapy［J］.Ann Surg Oncol，2008，15(12）：3471～3477.

［2］陳闖譚曉虹，岑洪，等.鼻咽癌組織中微淋巴管和微血管密度的觀察及其臨床意義［J］.重慶醫學，2012，(16）： 1582～1584.

［3］李菊蘭，蔡華成，黎志強，等.血管內皮生長因子和微血管密度在鼻咽癌組織中的表達［J］.中國耳鼻咽喉頭頸外科，2009，16(12）：702.

［4］Xu XR，Wang BR，Zhang Y，et al.Radiotherapeutic treatment of a fighter pilot with nasopharyngeal carcinoma［J］.Aviat Space Environ Med，2014，85(10）：1056～1060.

［5］Foote RL，Weidner N，Harris J.Evaluation of tumor angiogenesis measured with microvessel density(MVD）as a prognostic indicator in nasopharyngeal carcinoma：results of RTOG 9505［J］.Int Radiat Oncol Biol Phys，2005，1(3）： 745～753.

［6］倪昊生，倪炳華，劉益飛.鼻咽癌組織中VEGF、Ang－2、MVD的表達及意義［J］.江蘇醫藥，2011，37(21）：2521～2523.

［7］江河，蘭桂萍，翁敬錦，等.淋巴管標記物Podoplanin、D2－40在鼻咽癌組織中的表達及臨床意義［J］.醫藥前沿，2012，32(11）：60～61.

［8］周日晶，翁敬錦，司勇鋒，等.p53基因治療對鼻咽癌患者CD34標記的微血管密度和血小板計數的影響［J］.廣西醫學，2014，36(2）：187～190.

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10.3969/j.issn.1006－6233.2015.06.034

1006－6233(2015）06－0975－04

廣西壯族自治區醫療衛生重點科研課題，(編號：200721）