超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定不同茶葉中草甘膦、氨甲基膦酸及草銨膦的殘留

諸力 陳紅平 周蘇娟 王川丕 劉新

(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所農(nóng)業(yè)部茶葉產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實(shí)驗(yàn)室(杭州)，杭州310008)

1 引言

草甘膦(Glyphosate)作為無選擇類除草劑，以其高效、低毒、廉價等特性被廣泛運(yùn)用于全球各個農(nóng)業(yè)和非農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［1］。草銨膦(Glufosinate)可以有效去除絕大部分耐草甘膦雜草，且具有環(huán)保易降解等特點(diǎn)而受到各界青睞。隨著草甘膦、草銨膦使用頻率不斷上升，特別是在茶園中的運(yùn)用日益劇增，其殘留問題越來越受到關(guān)注，在2013 歐盟農(nóng)殘標(biāo)準(zhǔn)-茶葉中規(guī)定，草甘膦和草銨膦最高殘留限量(MRL)值分別為2.0 和0.1 mg/kg。草甘膦及其主要降解產(chǎn)物氨甲基膦酸(Aminomethyl phosphonic acid，AMPA)和草銨膦之間化學(xué)結(jié)構(gòu)相似，都具有易溶于水，難溶于一般有機(jī)溶劑，難揮發(fā)，缺少發(fā)色和熒光基團(tuán)等特性，因此運(yùn)用常規(guī)方法進(jìn)行檢測比較困難。

目前，草甘膦檢測方法有色譜法(GC［2］、LC［3，4］、IC［5，6］)、分光光度法［7］、質(zhì)譜法(GC-MS［8］、LC-MSMS［9～11］)及電感耦合等離子光譜法(ICP)［12］等，但大部分方法存在靈敏度低、操作程序繁瑣、有機(jī)試劑污染嚴(yán)重等缺點(diǎn)，也難以直接運(yùn)用于茶葉農(nóng)殘檢測領(lǐng)域。

茶葉作為有典型基質(zhì)效應(yīng)的經(jīng)濟(jì)作物，其草甘膦和草銨膦檢測文獻(xiàn)報道甚少。食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)-食品中農(nóng)藥最大殘留限量GB2763-2014 規(guī)定，茶葉中草甘膦指定檢測方法SN/T 1923-2007 最低定量限為0.1mg/kg，而草銨膦并未指定相應(yīng)檢測標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)通過“堿提酸沉”pH 值調(diào)控及Oasis HLB 小柱凈化后FMOC-Cl 衍生前處理，采用可編程多反應(yīng)監(jiān)測(Scheduled MRM)，建立了一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定不同茶葉(綠茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶)中草甘膦、氨甲基膦酸及草銨膦的方法。本方法穩(wěn)定、簡便、靈敏，可滿足各類茶葉檢測需求。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

API 3200 型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜(美國AB 公司);Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀(Waters 公司);Mill-Q 去離子水發(fā)生器(美國Millipore 公司);Sigma 3-16L 離心機(jī)(德國Sigma 公司);Oasis HLB固相萃取柱(3 mL/60 mg，Waters 公司)。

草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)樣品(純度≥98.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司);氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，不低于98.0%，百靈威公司);甲醇、乙腈(色譜純，百靈威公司);甲酸銨(99.9%，德國Sigma 公司);甲酸(95%，德國Sigma 公司);KOH(分析純，杭州蕭山化學(xué)試劑廠);HCl(36% ～38%，優(yōu)級純，江蘇永華精細(xì)化學(xué)品有限公司);硼酸鈉(Na2B4O7·10H2O，99.5%，太倉美達(dá)試劑有限公司);5%(V/V)硼酸鹽緩沖溶液(pH=9)。

茶葉樣品來源于浙江省各茶葉市場及各大超市。

2.2 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Waters ACQUITY HSS T3 (100 mm × 2.1 mm，1.8 μm);流動相:含0.1%甲酸-1 mmol/L甲酸銨溶液(流動相A)和甲醇溶液(流動相B);梯度洗脫程序:0 ～1 min，10% B;1 ～6 min，10% ～100% B;6 ～6.1 min，100% ～10% B;6.1 ～7.0 min，10% B。流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10.0 μL;柱溫:40 ℃;運(yùn)行時間:7 min。

離子源:電噴霧離子源(ESI)，溫度500 ℃，電壓5500 V;掃描方式:正離子模式;霧化氣GS1 壓力:50 psi;霧化氣GS2 壓力:50 psi;定性與定量離子對、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等參數(shù)見表1。

表1 草甘膦、草銨膦及氨甲基膦酸衍生物質(zhì)譜條件參數(shù)Table 1 MS conditions for derivatizations of glyphosate，glufosinate and aminomethyl phosphonic acid (AMPA)

2.3 樣品制備

提取:稱取2.0 g 茶葉試樣于50mL 離心管，加入0.05 mol/L KOH 溶液15 mL，搖勻靜置20 min。經(jīng)5000 r/min 離心10 min，過濾，取濾液2 mL 至5 mL 離心管，加入5 mol/L HCl 溶液20 μL，振蕩均勻后經(jīng)5000 r/min 離心10 min，得到上清液。

凈化:取1 mL 上清液至Oasis HLB(3 mL/60 mg)小柱(小柱活化:先加2 mL 甲醇淋洗，再加2 mL水活化)，經(jīng)過柱后，用5 mL 離心管接取凈化流出液。

衍生:凈化液中加入0.2 mL 硼酸鈉緩沖溶液，搖勻后再加入0.1 mL 10 g/L FMOC-Cl 衍生試劑，振蕩均勻后靜置2 h。將衍生后液體試樣10000 r/min 離心10 min，經(jīng)0.22 μm 水系濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

分別稱取3 種標(biāo)準(zhǔn)品各0.05 g，用水溶解并定容至50 mL 塑料容量瓶，分別配制成1000 mg/L 標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃下保存待用。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制:采用空白茶葉(綠茶、紅茶、烏龍茶、普洱茶)，經(jīng)2.3 節(jié)提取凈化，分別配制成6 個不同濃度濃度(5 ～1000 μg/L)的基質(zhì)標(biāo)樣，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)

稱取不同茶葉空白樣2 g，分別添加當(dāng)量為0.1、0.4 和4.0 mg/kg 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度水平重復(fù)6 次，經(jīng)2.3 節(jié)提取凈化處理，采用各茶葉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和定量限。

3 結(jié)果與討論

3.1 質(zhì)譜和色譜條件優(yōu)化

分別取草甘膦、草銨膦及氨甲基膦酸濃度為8 mg/L 標(biāo)樣進(jìn)行衍生，用于衍生化合物質(zhì)譜條件優(yōu)化。本研究采用ESI+模式，選擇各準(zhǔn)分子離子［M +H］+作為母離子，進(jìn)行二級質(zhì)譜優(yōu)化，參數(shù)包括電噴霧電壓、碰撞電壓(CE)、去簇電壓(DP)、電離溫度等，優(yōu)化結(jié)果見表1。采用可編程多反應(yīng)監(jiān)測(Sched-uled MRM，SMRM)，該模式可以不分時間段同時進(jìn)行多種殘留農(nóng)藥檢測，極大提高了MRM 檢測通量，有效改善峰形，提高重現(xiàn)性［13］。

研究表明，3 種衍生化合物在HSS T3 柱中的保留強(qiáng)度優(yōu)于普通C18柱，故予以采用。流動相優(yōu)化包括甲醇-水、乙腈-水、甲醇-水(0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸銨)、乙腈-水(0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸銨)。結(jié)果表明，采用甲醇-水(0.1%甲酸和1 mmol/L 甲酸銨)作為流動相可提高目標(biāo)化合物離子化效率，緩沖體系進(jìn)一步增加系統(tǒng)穩(wěn)定性，3 種化合物分離度和靈敏度都達(dá)到最佳。采用2.2 節(jié)梯度程序洗脫，不斷增加流動相中甲醇的比例，有助于降低基質(zhì)對目標(biāo)化合物檢測干擾，同時可有效減少雜質(zhì)對色譜柱的污染［14］。圖1 為0.04 mol/L 綠茶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)、空白綠茶樣品溶液(B)、加標(biāo)0.4 mg/kg 綠茶樣品溶液(C)中3 種衍生化合物的二級質(zhì)譜總離子流色譜圖。由圖1 可見，分離效果良好，目標(biāo)化合物出峰段雜質(zhì)干擾較小。

圖1 0.04 mol/L 綠茶基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液(A)、空白綠茶樣品溶液(B)、添標(biāo)0.4 mg/kg 綠茶樣品溶液(C)中3 種衍生化合物的二級質(zhì)譜總離子流圖Fig.1 MS/MS total ion chromatograms of derived compounds in matrix standard solution (A)，blank solution (B)and 0.4 mg/kg spiked concentration levels (C)of green tea

3.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

草甘膦、草銨膦和氨甲基膦酸都屬于強(qiáng)極性化合物，通常采用純水或水/二氯甲烷混合作為提取溶劑［15］。由于茶葉富含色素、糖、氨基酸、多酚類等大量水溶性雜質(zhì)，采用純水提取時，會導(dǎo)致提取液成分復(fù)雜，目標(biāo)化合物離子化效率過低［16］，方法定量限難以滿足檢測要求。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)比較后選擇強(qiáng)堿溶液，主要原因是:在堿性環(huán)境下，弱酸性草甘膦等會反應(yīng)生成相應(yīng)鹽，可提高其溶解率，而且茶多酚更易氧化生成沉淀，達(dá)到初步凈化目的。

在提取率研究方面，本研究將預(yù)先篩選的陽性綠茶樣品A(含草甘膦和氨甲基膦酸)和B(含草銨膦)作為提取實(shí)驗(yàn)試樣。以下各分析均設(shè)定以最理想條件下所測定值(Relative detection value)為1 作為衡量標(biāo)準(zhǔn)。對樣品A 和B 分別進(jìn)行0 ～10 mol/L 不同濃度KOH 溶液進(jìn)行提取，并且添加相應(yīng)濃度HCl 溶液，用以調(diào)節(jié)pH 值至中性而不影響衍生效率。如圖2 所示，采用純水作為提取溶液，效果不理想，A和B 樣品中3 種化合物草甘膦、草銨膦、氨甲基膦酸測定結(jié)果僅為0.31，0.42，0.38;0.05 mol/L KOH 提取效果最優(yōu)。

利用HCl 調(diào)節(jié)pH 值，按照2.3 節(jié)提取，離心后取上清液2 mL，分別添加0 ～5 mol/L HCl 溶液0.1 mL，調(diào)至中性。如圖2 所示，在HCl 濃度為1 mol/L 時，實(shí)測值最高，而未添加HCl 溶液組測定結(jié)果為0.56，0.65，0.63。造成該結(jié)果原因可能是:HCl 打破了原有茶湯中的電解質(zhì)平衡，在離子效應(yīng)、電解質(zhì)作用和共沉效應(yīng)等共同作用下，茶多酚、氨基酸、糖類等聚合成大分子物質(zhì)形成絡(luò)合物而沉淀［17］，凈化效果提高。

圖2 不同濃度KOH 提取(a)和不同濃度HCl 調(diào)控(b)對3 種化合物相對測定值的影響Fig.2 Detectable results of three compounds (a)extracted by different concentrations of KOH and(b)regulated by different concentrations of HCl

本研究選擇Oasis HLB(3 mL/60 mg)小柱，其填料為親水親脂的反相吸附劑，由N-乙烯吡咯烷酮和親脂性二乙烯基苯聚合而成，已在抗生素［18］、激素［19］等檢測領(lǐng)域廣泛運(yùn)用。分別將50 和500 μg/L的3 種化合物溶劑標(biāo)樣通過HLB 小柱凈化，測得回收率在92.3% ～106.9%之間，說明該小柱并未對3 種化合物產(chǎn)生吸附，因此本方法直接接取凈化流出液進(jìn)行衍生［9］，省去傳統(tǒng)洗脫、濃縮等步驟，縮短操作流程。通過測定過柱前后茶葉提取液發(fā)現(xiàn)，該過程中去除了95.6%茶多酚、90.4%咖啡堿及53.2%氨基酸，證明凈化效果良好。

FMOC-Cl 衍生機(jī)制［11，20］是在堿性環(huán)境(pH=9)下通過FOMC-基團(tuán)取代目標(biāo)化合物氮原子上的氫，從而生成較穩(wěn)定的化合物FOMC-R。在不同茶葉基質(zhì)中添加過量衍生試劑條件下，對衍生反應(yīng)時間、溫度及pH 值進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，反應(yīng)2 h 后，測得衍生化合物無明顯增加，改變溫度對衍生率影響不大，pH=9 時衍生率最佳。

3.3 線性范圍、相關(guān)系數(shù)和基質(zhì)效應(yīng)評價

采用2.4 節(jié)中制備的各基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按優(yōu)化后檢測條件進(jìn)樣，以各定量離子對峰面積對應(yīng)濃度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到3 種化合物線性方程及其相關(guān)系數(shù)。由表2 可見，3 種化合物在5 ～1000 μg/L 濃度范圍內(nèi)線性良好(R2＞0.99)。草甘膦和草銨膦衍生物在不同基質(zhì)中基質(zhì)效應(yīng)(Matrix effect，Me)不明顯，范圍在89.7% ～103.3%之間。氨甲基磷酸衍生物在綠茶中無明顯基質(zhì)效應(yīng)，但在烏龍茶和普洱茶中Me 分別為73.8%和76.4%，其中基質(zhì)抑制最強(qiáng)為紅茶，Me 達(dá)60.2%，原因可能是茶葉經(jīng)不同程度發(fā)酵產(chǎn)生的色素等會對目標(biāo)化合物測定產(chǎn)生影響。為消除基質(zhì)效應(yīng)干擾，本研究采用相應(yīng)基質(zhì)匹配標(biāo)樣進(jìn)行校準(zhǔn)。

表2 不同茶葉基質(zhì)中3 種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)及添標(biāo)回收率、精密度和方法定量限(n=6)Table 2 Linear equations，correlation coefficients，average recoveries，relative standard deviation(RSD)，and limit of quantification(LOQ)of three compound in different matrix(n=6)

3.4 回收率、精密度和方法定量限

取不同茶葉2 g，分別添加0.1，0.4 和4 mg/kg 混合標(biāo)樣，按照前述方法處理平行測定6 次，回收率和精密度見表2。不同茶葉基質(zhì)中3 種化合物添標(biāo)回收率范圍在72.1% ～109.9%之間，RSD(n =6)在0.5% ～9.8%之間，表明所建方法重復(fù)性良好。以10 倍信噪比(S/N)計(jì)算方法定量限(LOQ)在0.03 ～0.08 mg/kg 之間。

3.5 實(shí)際樣品分析

運(yùn)用此方法對市場247 份樣品進(jìn)行測試，其中綠茶146 份、紅茶44 份、烏龍茶42 份、普洱茶15 份。測試結(jié)果，草甘膦和草銨膦檢出樣品分別為46 份和4 份，目標(biāo)物含量范圍為0.105 ～3.223 mg/kg 和0.124 ～1.351 mg/kg(統(tǒng)一檢出限為0.1 mg/kg)。本方法可滿足歐盟對茶葉制定農(nóng)藥最高殘留限量(MRLs)要求，為茶葉行業(yè)中制定相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

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