超高效液相色譜-質譜法檢測土壤中的羥基化多溴聯苯醚

徐能斌 錢飛中 馮加永 汪晟樂 洪正昉 徐立紅 陳鐘佺

1(寧波市環境監測中心，寧波315012)

2(浙江省環境監測中心，杭州310012)

3(紹興市環境監測中心，紹興312000)

1 引言

多溴聯苯醚(Polybrominated diphenyl ethers，PBDEs)是一類最廣泛使用的溴代阻燃劑，在紡織、橡膠、電子電器等產品中以物理摻雜的方式大量使用。PBDEs 在使用過程中可以通過揮發、滲出等方式釋放到外界環境中，從而造成大氣、水、土壤及生物圈的環境污染［1］。其在環境中的主要代謝產物羥基化多溴聯苯醚(Hydroxylated polybrominated diphenyl ethers，OH－PBDEs)在環境介質(水、土壤)及生物體內(魚類、鳥類、哺乳動物)中陸續被檢出［2～4］。OH－PBDEs 能與甲狀腺素轉運蛋白結合，具有雌激素效應，毒性甚至比前體物PBDEs 更強，并被證明可以在血液中累積，存在巨大的環境危害［5～8］。土壤是電子垃圾的主要污染介質，PBDEs 從電子垃圾中遷移釋放到土壤中之后，被微生物降解為OH－PBDEs［3］。

氣相色譜－質譜(GC－MS)［8～11］和液相色譜－串聯質譜(LC－MS/MS)［12，13］是OH－PBDEs 的主要檢測方法。GC－MS 方法靈敏度高，但分析時間長，需要對樣品進行衍生化處理，衍生化反應不充分且難以控制，同時反應中需要重氮甲烷、硫酸二甲酯、硫酸二乙酸等有毒物。LC－MS/MS 技術檢測速度快，無需衍生化處理。土壤中的OH－PBDEs 等新型持久性有機污染物(Persistent organic pollutants，POPs )類物質前處理過程一般較為復雜，通常采用加速溶劑萃取或者索氏提取等方法將樣品從土壤基質中提取出來，然后采用酸性硅膠、中性硅膠或者凝膠色譜等手段除去土壤中的脂類物質和其他雜質，需要多次的濃縮和柱萃取過程，不僅需要加速溶劑萃取儀或凝膠色譜儀等昂貴的儀器，還消耗大量的試劑、時間和人力［14］。QuEChERS(Quick，easy，cheap，effective，rugged and safe)技術是近年發展起來的集萃取和凈化為一體的新型前處理方法，在食品、生物和日用品檢測中廣泛應用［15，16］，而在土壤POPs 研究中應用較少。本研究利用QuEChERS 技術對土壤中的OH－PBDEs 進行提取凈化，結合超高效液相色譜－串聯質譜(UPLC－MS/MS)技術，實現了土壤中OH－PBDEs 的高靈敏的快速檢測，并成功用于電子垃圾拆解地實際土壤樣品的檢測。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Acquity UPLC 超高效液相色譜系統，Quattro Premier XE 三重四級桿質譜儀(美國Waters 公司);BEH 反相C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司);CT14RD 冷凍離心機(上海天美公司);冷凍干燥機(北京博醫康公司);渦旋振蕩器(江蘇其林貝爾公司);50 和15 mL 具塞刻度離心管(美國Waters 公司)。

3′－OH－BDE－028，4－OH－BDE－042，5－OH－BDE－047，6－OH－BDE－047，4′－OH－BDE－049，2′－OH－BDE－068，5′－OH－BDE－099，6′－OH－BDE－099(OH－BDE:羥基化溴代聯苯醚，純度≥97%，美國AccuStandard 公司);無水MgSO4、NaCl、吸附劑填料正丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)、C18(美國Waters 公司);甲醇、乙腈、甲酸(HPLC 級，美國Fisher 公司);實驗用水為超純水。

2.2 樣品采集及前處理

樣品在浙江省寧波市江北區某電子垃圾拆解地周圍采集，采集的樣品均為深度在20 cm 以內的表層土壤。將采集的樣品去除石子、植物根莖等雜質，在冷凍干燥機中冷凍干燥48 h，研磨均勻，過0.6 mm 篩，裝于密閉容器中，于-20 ℃避光保存。

稱取5 g 土壤樣品于50 mL 具塞刻度離心管中。加入10 mL 水浸潤樣品20 min，然后加入0.2 mL甲酸和10 mL 乙腈，渦旋萃取3 min;再加入4 g 無水MgSO4和1 g NaCl，渦旋振蕩3 min，以12000 r/min高速離心5 min。從粗提液中取4 mL，轉移至已提前放入0.3 g 無水MgSO4、0.1 g C18、0.02 g 正丙基乙二胺(PSA)的15 mL 離心管中，渦旋振蕩3 min，以12000 r/min 高速離心5 min。精提液用0.2 μm 濾膜過濾后上機檢測。

2.3 色譜-質譜條件

2.3.1 色譜條件 色譜條件:柱溫50 ℃;流速0.4 mL/min;進樣量5.0 μL;分離時間9 min。流動相:A 為乙腈;B 為水。梯度淋洗:0 ～1 min，60% A;1 ～4 min，60% ～85% A;4.1 ～6 min，100% A;6 ～9 min，60% A。

2.3.2 質譜條件 三重四級桿串聯質譜多反應監測(MRM);ESI 負離子電離模式;毛細管電壓2.7 kV;離子源溫度120 ℃;脫溶劑氣溫度350 ℃;脫溶劑氣流量650 L/h;錐孔氣流量50 L/h，各目標化合物的質譜分析參數見表1。

表1 質量分析參數Table 1 Parameters of MS for hydroxylated polybrominated diphenyl ethers (OH－PBDEs)

3 結果與討論

3.1 色譜條件優化

OH－PBDEs 屬于典型的弱極性化合物，使用普通C18色譜柱即可得到相對比較良好的峰形和分離度(圖1);通過BEH C18、BEH Phenyl、HSS C18、HSS T3(規格均為100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters公司)4 種色譜柱，在不同流動相色譜條件下均難以將4′－OH－BDE－049 和5－OH－BDE－047 分離，只能進行質譜分離。醋酸銨、甲酸等緩沖鹽的使用對于目標物的質譜響應和色譜分離均無明顯提高。乙腈/水體系與甲醇/水體系在分離OH－PBDEs 時，在響應和分離度方面區別不大，使用乙腈/水體系在降低柱壓方面具有較明顯優勢，比同比例甲醇/水低6.895 ～13.75 MPa(流速為0.4 mL/min)。OH－PBDEs 在普通液相色譜(HPLC)柱中很容易出現柱過載現象［17，18］，本實驗在超高效液相色譜(UPLC)中對0 ～20 μL進樣量進行了比較，結果進樣量超過8 μL 即可能出現過載現象(BEH C18色譜柱，100 mm ×2.1 mm，1.7 μm)。

圖1 OH－PBDEs 的總離子流圖及各反應通道中出現的化合物色譜圖，混標中每種化合物濃度為100 μg/L，分別為:(1)3′－OH－BDE－028，2.83 min;(2)4－OH－BDE－042，3.17 min;(3)5－OH－BDE－047，3.43 min;(4)6－OH－BDE－047，3.43 min;(5)4′－OH－BDE－049，3.60 min;(6)2′－OH－BDE－068，3.74 min;(7)6′－OH－BDE－099，4.10 min;(8)5′－OH－BDE－099，4.22 minFig.1 Total ion chromatogram for all the MRM channels and the individual MRM chromatogram of 100 μg/L of OH－PBDEs standard mixture for (1)3′－OH－BDE－028，2.83 min;(2)4－OH－BDE－042，3.17 min;(3)5－OHBDE－047，3.43 min;(4)6－OH－BDE－047，3.43 min;(5)4′－OH－BDE－049，3.60 min;(6)2′－OH－BDE－068，3.74 min;(7)6′－OH－BDE－099，4.10 min and (8)5′－OH－BDE－099，4.22 min

3.2 質譜條件優化

質譜條件的優化是通過在流動注射模式下對1.0 mg/L 的各OH－PBDEs 單獨進樣完成的。首先比較ESI 和APCI 兩種電離源。在SIM 模式下，ESI 中8 種OH－PBDEs 的靈敏度明顯高于APCI。與六溴環十二烷、四溴雙酚A 等其它溴代阻燃劑相似，OH－PBDEs 在ESI 負離子模式下得到的響應比正離子模式更好。由于準分子離子均為［M－H］－，三溴聯苯醚的準分子離子質荷比為420，四溴聯苯醚為500，五溴聯苯醚為580。3′－OH－BDE－028，5－OH－BDE－047，5′－OH－BDE－099 的主要反應通道為［M － H］－→［M－Br］－;6－OH－BDE－047，2′－OH－BDE－068，6′－OH－BDE－099 主要反應通道為［M －H］－→［Br］－;4－OH－BDE－042，4′－OH－BDE－049 的主要反應通道為［M－H］－→［M－C6H3Br2］－。4－OH－BDE－042，5－OHBDE－047，6－OH－BDE－047，2′－OH－BDE－068 等具有相同的母離子質荷比和相同的子離子碎片，需要通過色譜分離才能進行定性分析。

3.3 QuEChERS處理條件優化

3.3.1 萃取溶劑的優化 含水率是QuEChERS 萃取的重要參數。QuEChERS 最初的設計是針對水果、蔬菜、生物體等含水率超過75%的環境基質［19］，而土壤的含水率偏低，因此需要加入2 mL/g 的水，使土壤充分浸潤;萃取溶劑選取了不同比例乙腈－水混合溶劑，該溶劑體系可以在液相色譜中直接使用，不需要溶劑置換。甲酸的加入可有效提高回收率，萃取溶劑、甲酸的加入量與空白樣品加標回收率的關系見圖2。在只加乙腈的情況下，8 種OH－PBDEs 回收率均不足50%;加入50%水后，回收率為70% ～94%，再加入0.2 mL 甲酸后，回收率為85% ～106%。

3.3.2 吸附劑的優化 目前常用的吸附劑主要有C18、PSA(正丙基乙二胺)和GCB(石墨化炭黑)。C18比較適合去除脂類等疏水性雜質，但是也有可能會去除目標物OH－PBDEs;PSA 是一種弱陰離子交換劑，主要用于去除脂肪酸，這些干擾物在ESI 負離子模式下對目標物產生嚴重的離子抑制現象［19］，但是過量使用PSA 會引起萃取液pH 值上升，目標物靈敏度下降;GCB 主要用于去除色素類物質，對于芳香族化合物具有較強的去除能力。實驗結果如圖3 所示，GCB 的加入雖然有助于萃取液更澄清，但是目標物回收率明顯降低，因此，不加入GCB;加入0.1 g C18(優化范圍0.02 ～0.20 g)和0.02 g PSA(優化范圍0.01 ～0.05 g)是去除干擾物、保證靈敏度的最佳選擇。

圖2 使用不同萃取溶劑時OH－PBDEs 的回收率Fig.2 Recoveries of OH－PBDEs using different extraction solvents

3.4 基質效應

基質效應(Matrix effects)是影響LC－MS/MS 測量準確度和精確度的重要因素，具體的計算方法為:

其中，A1為某濃度的OH－PBDEs 在純溶劑中的平均峰面積;A2為相同濃度下的OH－PBDEs 在空白土壤萃取液中的平均峰面積。3 種濃度的基質加標回收實驗表明，在使用QuEChERS 方法處理土壤樣品后，8 種OH－PBDEs 的基質效應值均小于20%(表2)。

圖3 使用不同吸附劑時OH－PBDEs 的回收率(吸附劑加入量:C18，0.1 g;PSA，0.02 g;GCB，0.02 g)Fig.3 Recoveries of OH－PBDEs using different sorbent(the sorbent:C18，0.1 g;PSA，0.02 g;GCB，0.02 g)

表2 土壤萃取液中OH－PBDEs 的基質效應(單位:%)Table 2 Matrix effects of OH－PBDEs in soil extracts(%)

3.5 方法驗證

由表3 可知，在2 ～200 μg/L 范圍內，8 種OHPBDEs 在LC－MS 中的響應具有良好的線性關系，相關系數(R2)范圍為0.9936 ～0.9990，滿足定量分析的需求;3 倍信噪比(S/N=3)下8 種OH－PBDEs 土壤中的檢出限達到0.23 ～1.21 ng/g，略低于采用復雜的PBDEs 在空白土壤萃取液中的平均峰面積。3 種濃度的基質加標回收實驗表明，在使用QuEChERS 方法處理土壤樣品后，8 種OH－PBDEs的基質效應值均小于20%(表2)。

3.5 方法驗證

由表3 可知，在2 ～200 μg/L 范圍內，8 種OH－PBDEs 在LC－MS 中的響應具有良好的線性關系，相關系數(R2)范圍為0.9936 ～0.9990，滿足定量分析的需求;3 倍信噪比(S/N=3)下8 種OH－PBDEs 土壤中的檢出限達到 0.23 ～1.21 ng/g，略低于采用復雜的多次凈化和濃縮方式進行前處理的方法［14］，但是完全能夠滿足土壤中痕量OH－PBDEs 檢測的需求。在5.0，50 和150 ng/g濃度水平6 次平行加標實驗中，8 種OH－PBDEs 加標回收率范圍為73.2% ～117.7%，相對標準偏差(RSD)為5.6% ～19.7%，精密度和準確度較好。

3.6 實際樣品分析

在浙江省寧波市江北區某電子垃圾拆解點采集了拆解點、焚燒點以及周邊菜地的土壤進行了實際樣品分析，僅在拆解點檢出了5－OH－BDE－047 和6－OH－BDE－047，濃度分別為2.2 和1.5 ng/g，其它化合物未檢出。

表3 線性范圍、相關系數、加標回收率、相對標準偏差、檢出限Table 3 Linear range，correlation coefficient，spiked recoveries，relative standard derivations and limits of detection

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