快原子轟擊離子化質譜研究酚類化合物抗氧化作用

楊芬 賀玖明 張瑞萍 再帕爾·阿不力孜

1(中國醫學科學院/北京協和醫學院藥物研究所，天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京100050)

2(北京腫瘤醫院，北京100142)

1 引言

氧自由基與心腦血管、腫瘤及老年性疾病的發生具有密切關系［1～4］，抗氧化藥物在臨床、保健、食品等領域被廣泛應用，尋找高效、低毒的抗氧化劑備受重視。目前，檢測或評價化合物抗氧化活性的常用方法有電子自旋共振法［5～7］、電化學方法［8］、色譜法［9，10］和液相色譜質譜聯用法(LC-MS)［11，12］等。這些檢測方法的共同點是樣品處理時間長、檢測及其數據處理繁瑣，包括羥自由基(·OH)的產生體系以及化合物捕捉·OH 的反應，對大量樣品的快速檢測具有一定的局限性。因此，建立一種簡便、快速檢測化合物抗氧化作用強弱的新型分析方法，對加快抗氧化藥物的篩選及研發具有重要意義。

快原子轟擊離子化質譜(FAB-MS)方法是一種成熟的質譜技術。大多數化合物的FAB-MS 譜中主要產生［M+H］+離子，也有一些化合物產生比較強的分子離子M+·。本實驗室前期探索了FAB-MS 譜中M+·的相對強度與化合物抗氧化作用強弱的相關性［13］，在此基礎上，本實驗系統考察了實驗條件對M+·相對強度的影響，建立了篩選或預測酚類化合物抗氧化作用強弱的簡便、靈敏、快速的FAB-MS 檢測方法，并且與常用藥理活性篩選方法進行對比分析，驗證了該方法的可靠性。由于FAB-MS 方法具有樣品量少、無需復雜樣品處理、檢測時間短等特點(可直接將樣品溶液與基質混合后涂于靶上測定)，因此本方法的建立將有助于加快抗氧化藥物的研發。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

AutoSpec Ultima-Tof 串聯質譜儀(英國Micromass 公司);FAB 源，Cs+離子槍，加速電壓8000 V，分辨率調節為1000。

甲醇(分析純，北京化工廠);FAB-MS 譜測定使用的基質:甘油(G，分析純，北京化工廠);間硝基芐醇(m-NBA，色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司);硫代甘油(TG)、二硫代蘇糖醇/硫代甘油(DTT/TG 12)和1，2 二巰基甘油(BAL)均為色譜純(日本Tokyo Kasei Kogyo 公司)。

黃酮類化合物、酚類化合物以及木脂素類化合物(中國藥品生物制品檢定所)。黃酮類化合物的結構式見表1。

表1 選用的黃酮類化合物及其結構Table 1 Structure of flavonoids

2.2 I(M+·)/I(［M+H］+)比值的計算

I(M+·)/I(［M+H］+)值表示M+·與［M +H］+離子的相對強度比值，扣除M+·峰13C 同位素對［M+H］+峰的貢獻后，獲得二者的相對峰強度比值。

基質為間硝基芐醇(m-NBA)，樣品用甲醇溶解。I(M+·)/I(［M +H］+)值均采用10 ～20 次掃描時間的平均結果。采用硫代巴比妥酸法(TBA)檢測化合物對脂質過氧化(LPO)的抑制率(IR)。

其中，AS和A0分別表示樣品溶液和空白對照液的吸光度值。

3 結果與討論

3.1 基質對I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響

選擇合適的基質進行FAB-MS 譜測定是關鍵環節。本研究選擇5 種酚類和黃酮類化合物，系統考察了基質對其I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響。由表2 可見，對于同一化合物，使用不同基質得到的I(M+·)/I(［M+H］+)值不同，m-NBA 最有利于M+·離子的形成。由表3 可見，不同化合物使用相同基質得到的I(M+·)/I(［M+H］+)值大小順序保持不變。因此，該值大小雖然與基質種類有關，但主要決定于化合物自身生成M+·和［M +H］+離子的競爭能力;同時說明采用相同基質比較不同化合物的I(M+·)/I(［M+H］+)值具有可行性。

表2 5 種不同基質條件下獲得的3 個酚類化合物的I(M +·)/I(［M+H］+)值Table 2 I(M +·)/I(［M+H］+)values of three phenolic compounds with five different matrices

3.2 轟擊時間對I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響

通常，FAB 條件下的離子化過程在空間上可分為凝聚相區、界面區、氣密層區和高真空區4 個區域。M+·離子和［M+H］+離子都要通過氣密層區進入高真空區，進而被檢測分析。因此，氣密層的穩定性對于M+·和［M+H］+離子的產生及其強度比較重要，本實驗通過考察化合物的離子化與轟擊時間的關系，尋找形成穩定氣密層區的階段。

表3 3 種不同基質條件下獲得的酚類化合物的I(M +·)/I(［M+H］+)值Table 3 I(M +·)/I(［M+H］+)values of some phenolic compounds with three different matrices

圖1 是以m-NBA 為基質測定阿魏酸的FAB-MS譜，m-NBA 的主要離子m/z 154，阿魏酸的M+·離子(m/z 194)和［M+H］+離子(m/z 195)的絕對強度隨轟擊時間的變化結果。可以看出，基質相關離子的強度隨著掃描次數的增加迅速增強，在大約5 次掃描后達到一個比較穩定的階段，而掃描25 次以后基質的相關離子峰強度逐漸變小。這一變化趨勢反映了氣密層區的形成與消逝過程，表明5 ～25 次的掃描時間內已形成穩定的氣密層區。在氣密層區被測樣品的I(M+·)/I(［M + H］+)值變化不明顯。因此，選擇10 ～20 次掃描結果作為判斷I(M+·)/I(［M+H］+)值大小的依據具有較好的可靠性。

圖1 阿魏酸與m-NBA(基質)的分子離子峰M +·和準分子離子峰［M+H］+絕度強度與轟擊時間的相關關系Fig.1 Relationship between absolute intensity of M +·，［M+H］+ion of ferulic acid，［M+H］+ion of matrix and scan time with m-NBA used as the matrix

3.3 樣品濃度對I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響

在FAB-MS 分析的實驗過程中，發現樣品濃度在1 ～200 mmol/L 范圍內，能得到較理想強度的分子離子和準分子離子峰。如果濃度太低，FAB-MS 譜給出的均為基質離子峰;而濃度太高，樣品的相關離子峰強度可能出現過飽和。因此，本實驗以木脂素類化合物為研究對象，考察了樣品濃度對I(M+·)/I(［M+H］+)值的影響。表4 給出了7 個木脂素類化合物在濃度分別為10 和50 mmol/L 獲得的I(M+·)/I(［M+H］+)值。如表4 所示，此值隨其濃度大小發生變化，而不同化合物在濃度相同時，其相對順序不變，由此可見，隨著樣品濃度的變化，I(M+·)/I(［M+H］+)值將按一定的規律發生變化，但不影響其相對大小順序。因此，對于同種結構類型的化合物而言，在相同濃度條件下進行FAB-MS 譜分析，獲得的I(M+·)/I(［M+H］+)值可以反映化合物的結構及其性質差異。

表4 不同濃度木脂素類化合物以m-NBA 為基質時獲得的I(M +·)/I(［M+H］+)值Table 4 I(M +·)/I(［M+H］+)values of different concentration of lignanoids compounds with m-NBA used as the matrix

3.4 黃酮類化合物I(M+·)/I(［M+H］+)值與其抗氧化活性的相關性

在FAB 條件下，M+·離子的產生過程與酚類抗氧化物的抗氧化作用機制存在一定相關性，二者都包含電子轉移的過程，而且失去電子的難易程度與M+·離子的相對強度有關，并在一定程度上決定了抗氧化作用的強弱。大部分酚類化合物是斷鏈型抗氧化劑，它們通過清除自由基發揮其抗氧化作用［14］。抗氧化劑與自由基發生反應生成苯氧自由基，苯氧自由基穩定性越好，表明化合物的抗氧化活性越強［14］。有利于增強苯氧自由基穩定性的結構因素主要有:酚羥基鄰對位有O、N、S 等雜原子或斥電子基團的取代以及分子內氫鍵的形成等。這些因素同樣有利于FAB 條件下M+·離子的產生，這是由于O、N 等雜原子與苯環形成p-π 共軛，共軛效應使單電子離域程度增大，則有利于形成M+·離子。因此，有利于提高苯氧自由基穩定性的結構因素，既能增強酚類化合物的抗氧化活性，也同樣有利于M+·離子的產生，從而使I(M+·)/I(［M +H］+)值增大。因此對于同種結構類型的酚類化合物，其FABMS 譜中若出現比較強的M+·離子，則該化合物可能具有較強的抗氧化活性，且抗氧化作用強弱與I(M+·)/I(［M+H］+)值大小具有一定的相關性。

3.5 黃酮類化合物的結構類型與I(M+·)/I(［M+H］+)值

黃酮類化合物的抗氧化活性是眾所周知的，根據其結構特征又可分為黃酮醇、黃酮、異黃酮等不同類型結構。本研究選擇了3 種黃酮類化合物進行了系統考察與比較分析。其中，Ⅰ-1 ～Ⅰ-5 屬于黃酮醇類化合物，結構區別主要在于B 環羥基數目和位置。I(M+·)/I(［M +H］+)值分別為0.81，0.79，0.76 和0.7，差異不大，可能原因分析如下:①從結構因素考慮，B 環與A、C 環平面幾乎處于垂直的位置，且B 環與C 環之間C1’-C2 鍵的鍵級為0.992，說明B 環與C 環的共軛程度很低［15］，故B 環羥基數目和位置的變化對共軛體系電子云密度的影響較小;②羥基的給電子能力能夠降低化合物的電離能，同時又易與基質形成氫鍵，又增加其質子親和力，綜合因素的影響結果造成其I(M+·)/I(［M +H］+)值的變化不大。另外，與其它化合物相比，Ⅰ-1 在B 環的3’-位上增加了甲氧基，更有利于M+·離子的產生，因此Ⅰ-1 的I(M+·)/I(［M+H］+)值大于其它同類化合物。

Ⅰ-6 ～Ⅰ-10 屬于黃酮類化合物，其中，Ⅰ-6 和Ⅰ-7 的I(M+·)/I(［M +H］+)值分別為0.82 和0.63，二者結構區別主要在于A 環取代基。由于A 和C 環共軛程度較高，取代基對共軛體系電子云密度的影響較大，從而影響M+·離子的強度。前者A 環有3 個鄰酚羥基取代，容易形成分子內氫鍵，有利于M+·離子的穩定，其I(M+·)/I(［M+H］+)值比較大。Ⅰ-8，Ⅰ-9 和Ⅰ-10 的結構區別為B 環羥基的數目不同，但其I(M+·)/I(［M+H］+)值的差異不大，分別為0.49，0.45 和0.45。分析其原因:一方面，B 環與C 環的共軛程度低，B 環取代的變化對共軛體系電子云密度影響不大;另一方面，羥基的給電子能力能夠降低化合物的電離能，又能增加化合物的質子親和力［16］，使其I(M+·)/I(［M+H］+)值變化不大。

Ⅰ-11，Ⅰ-12，Ⅰ-13 屬于異黃酮類化合物，其中，Ⅰ-11，Ⅰ-12 的主要區別是B 環羥基數目不同，其I(M+·)/I(［M+H］+)值差別不大，分別為0.60、0.55，可能原因與上述相同。與Ⅰ-12 相比，Ⅰ-13 的A 環5-位缺少羥基，而羥基的給電子能力有利于M+·離子的產生;同時，5-位羥基易與鄰位羰基形成分子內氫鍵，并不會提高其接受質子的能力，因此，Ⅰ-12 的相對較大，而Ⅰ-13 的I(M+·)/I(［M +H］+)值相對較小(0.35)。

以上結果及分析解釋了相關化合物在FAB-MS 譜中獲得的I(M+·)/I(［M +H］+)值的差異，并且從結構因素角度闡述了供電子基的存在將有利于FAB 條件下M+·離子的產生，同時也能提高酚類抗氧化物產生苯氧自由基的穩定性。

3.6 I(M+·)/I(［M+H］+)值與抗氧化活性的相關性

本實驗將I(M+·)/I(［M+H］+)值與文獻報道的黃酮化合物抗氧化活性的結果進行了比較，結果見表5。其中，TEAC(Trolox equivalent antioxidant activity)值表示化合物對ABTS+·陽離子自由基的清除能力［17］，Effect 值(%)表示化合物對羥自由基(·OH)的清除能力［18］。

從表5 可知，文獻報道的兩種方法獲得結果也不完全一致，但可反映出不同類型黃酮化合物的構效關系。例如，黃酮醇類化合物(Ⅰ-3，Ⅰ-4，Ⅰ-5)的抗氧化能力強于黃酮類(Ⅰ-9)和二氫黃酮類化合物(Ⅰ-14)，而且后兩類化合物的抗氧化活性大小比較接近。FAB-MS 法的結果表明，化合物I(M+·)/I(［M+H］+)值的大小也反映出了同樣的變化趨勢，即化合物的I(M+·)/I(［M+H］+)值越大，其抗氧化活性就越強。因此，FAB-MS 方法測定的I(M+·)/I(［M+H］+)值可以反映酚類化合物的抗氧化作用及其強弱。

3.7 方法驗證

為了驗證FAB-MS 方法的可靠性，對12 種酚類化合物進行了抗氧化能力的預測與評價。其中，Ⅱ-1 ～Ⅱ-3 是黃酮類化合物;Ⅱ-4 ～Ⅱ-6 是二苯乙烯類化合物;Ⅱ-7 ～Ⅱ-12 為復雜多酚化合物。通過FAB-MS 分析，得到I(M+·)/I(［M+H］+)值，并與其脂質過氧化的抑制能力進行了比較(TBA 法)，見表6。結果表明，這些化合物均表現出較強的抗氧化活性，這與FAB-MS 法預測的結果基本一致。本研究結果進一步表明，對于結構相似的化合物而言，I(M+·)/I(［M+H］+)值越大，其抗氧化作用越強。因此，證明FABMS 方法可以用于篩選或預測酚類化合物的抗氧化活性。

表5 由FAB-MS 譜獲得的I(M +·)/I(［M+H］+)值與其它方法獲得黃酮類化合物的抗氧化活性強弱的比較Table 5 Comparison of I(M +·)/I(［M +H］+)values obtained from the fast atom bombardment-MS (FAB-MS)spectra of flavonoids and antioxidant activity assayed by other method.

表6 由FAB-MS 譜得到的I(M +·)/I(［M +H］+)值與TBA 法獲得的12 種化合物的抗氧化活性的比較Table 6 Comparison of I(M +·)/I(［M + H］+)values obtained from FAB-MS spectra of 12 phenolic compounds and antioxidant activity assayed by TBA method.

4 結論

通過研究黃酮類化合物結構與FAB 譜中得到的I(M+·)/I(［M +H］+)值之間的關系，發現在FAB-MS 譜中有利于產生M+·離子的結構因素同樣有利于酚類抗氧化物清除自由基后產生的苯氧自由基的穩定性。采用FAB-MS 方法對12 個酚類化合物進行了抗氧化能力的預測與評價，其結果與TBA 法獲得的基本一致。本研究結果表明，對于同種結構類型的酚類化合物，由F AB-MS 法獲得的I(M+·)/I(［M+H］+)值能較好地反映其抗氧化作用的強弱。另外，FAB-MS 方法具有簡便、快速、靈敏度高及用樣量少等特點，可以作為酚類化合物抗氧化活性的體外篩選或預測方法，有助于加速抗氧化藥物的發現，因此具有良好的應用前景。

1 Halliwell B.Drugs Aging，2001，18(9):685 －716

2 LI Feng，LI Xiao-Gang.J.Military Surgeon in Southwest China，2013，15(2):182 －184

李鳳，李小剛.西南軍醫，2013，15(2):182 －184

3 FAN Hong-Bo.Mordern Med.J.China，2012，14(4):130 －132

范紅波.中國現代醫藥雜志，2012，14(4):130 －132

4 ZHAO Guan-Cong，WANG Tao.Med.Inform.，2013，26(3):337 －339

趙冠聰，王濤.醫學信息，2013，26(3):337 －339

5 Li L X，Abe Y，Kanagawa K，Usuia N，Imaia K，Mashinoa T，Mochizukia M，Miyatab N.Anal.Chim.Acta，2004，512(1):121 －124

6 Zhou K Q，Yin J J，Yu L L.Food Chem.，2006，95(3):446 －457

7 Vandjelovic N，Zhu H，Misra H P，Zimmerman R P，Jia Z，Li Y.Mol.Cell Biochem.，2012，364(1-2):71 －77

8 Wang Q，Ding F，Zhu N，Li H，He P，Fang Y.J.Chromatogr.A，2003，1016(1):123 －128

9 Tai C，Peng J F，Liu J F，Jiang G，Zou H.Anal.Chim.Acta，2004，527(1):73 －80

10 Sun T，Jia Z，Xu Z.Bioorg.Med.Chem.Lett.，2004，14(7):1779 －1781

11 Yue Q S，Kadiiska M B，Guo Q，Mason R P.Free Radic.Biol.Med.，2005，38(1):125 －135

12 Yang F，Zhang R P，He J M，Abliz Z.Rapid Commu.Mass Spectrom.，2007，21(1):107 －111

13 HE Jiu-Ming，Zeper Abliz，Yoshio Hano，Ryo Ogawa，LIU Zhan-Zhu，CHEN Shi-Zhi.J.Chin.Mass Spectro.Soc.，2003，24(2):346 －350

賀玖明，再帕爾·阿不力孜，羽野芳生，小川亮，劉站柱，陳世智.質譜學報，2003，24(2):346 －350

14 Szekely G，Allison J.J.Am.Soc.Mass Spectrom.，1997，8:337 －351

15 Acker S A，Koymans L M，Bast A.Free Radic.Biol.Med.，1993，15:311 －328

16 ZHANG Hong-Yu.Chemistry Online，2000 (13)http://lib.ecit.edu.cn/web/chemistry/2000/chemistrymag.org/col/2000/c00008.htm

張紅雨.化學通報(網絡版)，2000 (13)http://lib.ecit.edu.cn/web/chemistry/2000/chemistrymag.org/col/2000/c00008.htm

17 Zhang H Y.Science in China (series B)，1999，42:106 －112

18 Aue D H，Webb H M，Bowers M T.J.Am.Chem.Soc.，1972，94(13):4726 －4728

19 Rice-Evans C A，Miller N J，Paganga G.Free Radical.Biol.Med.，1996，20(7):933 －956

20 Husain S R，Cillard J，Cillard P.Phytochemistry，1987，26(9):2489 －2491