基于多肽微陣列芯片的熒光和共振光散射法篩選凝血酶抑制劑

蘇敏 李桃 劉殿駿 王振新

1(中國科學院長春應用化學研究所，電分析化學國家重點實驗室，長春130022)

2(中國科學院大學，北京100049)

1 引言

蛋白酶是水解蛋白質肽鍵的一類酶的總稱，凝血酶是一種重要的蛋白酶，主要參與血液凝結級聯反應，使血液凝結成塊阻止血液流失［1］。凝血酶與血栓栓塞性疾病的診斷和治療密切相關［2］，以凝血酶為靶點的抗凝血藥物是臨床用于治療血栓的主要藥物［3］，開發高效、價格低廉的抗凝血藥物是目前藥物學研究熱點［4，5］。

微陣列生物芯片技術可以在一張芯片上集成多種生物化學反應，能夠實現對生物活性物質高效快速地測試和分析［6，7］。固定蛋白酶或蛋白酶特異底物的微陣列芯片可以同時分析多種抑制劑與蛋白酶之間的作用機理和作用效率［8，9］。Uttamchandani 等用蛋白微陣列芯片同時檢測了3 種化合物對4 種半胱氨酸蛋白酶的抑制效率［10］;Neumann 等用小分子微陣列芯片從近10 萬個有機小分子中篩選出了6 種能與凝血酶活性位點結合的化合物［11］。迄今為止，仍鮮有使用多肽微陣列芯片在血液樣品中篩選凝血酶抑制劑的報道。

本研究利用多肽微陣列芯片反應平臺，熒光(Fluorescence)和共振光散射(Resonance Light Scattering，RLS)雙檢測手段，在血液樣品中檢測凝血酶抑制劑的抑制效率。雙通路檢測手段提高了檢測結果的準確性，在加標血清和血漿中檢測并比較了5 種化合物對凝血酶的抑制能力，并研究了在血漿中兩種抑制劑對凝血酶抑制作用的可逆性。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

晶芯?SmartArrayerTM136 微陣列芯片點樣系統和晶芯?LuxScan10K 微陣列芯片掃描儀(北京博奧生物技術有限公司);PMC082 芯片離心機(美國ChipMate 公司);SpotWareTM芯片掃描系統(美國Arrayit公司)。

人血液樣品從長春市中心血站暨吉林省血液中心獲得;熒光素標記的親和素(FITC-Avidin)、凝血酶(Thrombin)、阿加曲班(Argatroban)、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽(AEBSF)、胰蛋白酶抑制劑(Trypsin inhibitor)和N-(反式-環氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺(E-64)(美國Sigma-Aldrich 公司);光學級三維高分子D 基片(北京博奧生物有限公司);多肽:CALNN，CALNNGK(biotin)G 和CAEGGf-PRSFRVVK(biotin)(上海強耀生物科技有限公司);抗凝血酶Ⅲ(Human Antithrombin-Ⅲ，HAT-Ⅲ，美國HTI 公司);其它試劑均為國產分析純，實驗用水為Milli-Q 超純水(18.2 MΩ cm)。

2.2 實驗方法

2.2.1 血液樣品制備 血液采集后6 h 內離心分離血漿，并速凍制成新鮮冰凍血漿，-80 °C 保存。

用血漿稀釋緩沖液(pH 7.35，20 mmol/L HEPES，21.7 mmol/L 檸檬酸鈉，60 g/L BSA)將40 μL 血漿稀釋1 倍，加入20 μL 的激活劑(30 pmol/L 重組人組織因子和24 μmol/L 磷脂混合物(磷脂酰絲氨酸∶ 磷脂酰乙醇胺∶ 磷脂酰膽堿=1∶ 1∶ 3，摩爾比)，37 °C 孵育5 min。加入20 μL HEPES 緩沖液(pH 7.35，20 mmol/L HEPES，60 g/L BSA，0.1 mol/L CaCl2)，制成活化的血漿。

將活化血漿1300 g 離心10 min，分離得到血清。

2.2.2 金納米粒子探針制備 100 mL 超純水中加入2 mL 1% 氯金酸溶液，加熱至沸;加入2 mL 2%檸檬酸鈉溶液繼續加熱攪拌30 min，合成30 nm 粒徑的金納米粒子［12，13］。取120 μL 1 g/L CALNNCALNNGK(biotin)G 混合液(9∶1，V/V)，加入10 mL 4 nmol/L 金納米粒子溶液中，室溫靜置1 h;離心除去上清液，重懸于探針緩沖液(pH 7.5，50 mmol/L 磷酸鹽溶液，0.15 mol/L NaCl，0.1% (V/V)吐溫-20，1% (w/V)BSA)，4 °C 儲存［14］。

2.2.3 多肽微陣列芯片制備和酶水解過程 用點樣緩沖液(pH 8.5，0.3 mol/L 磷酸鹽，0.2 mol/L NaCl，35% (V/V)甘油，0.002% (w/V)BSA)配制0.5 g/L 多肽(CAEGGfPRSFRVVK(biotin))溶液，使用晶芯?SmartArrayerTM136 微陣列芯片點樣系統點樣于光學級三維高分子D 基片上，30 °C 反應14 h。芯片表面的醛基基團與多肽N 末端半胱氨酸殘基上的氨基和巰基基團共價反應形成五元環結構，使多肽固定于芯片表面［15］。用含0.1%(V/V)吐溫-20 的洗滌液-I(pH 7.5，50 mmol/L 磷酸鹽，1% (w/V)BSA)洗滌2 次;放入封閉液(pH 7.5，50 mmol/L 磷酸鹽，0.15 mol/L NaCl，1% (w/V)BSA，0.1 mol/L乙醇胺)30 °C 反應1 h;用超純水洗滌3 次，旋干(480 g，1 min)。

用酶反應緩沖液(pH 7.35，20 mmol/L HEPES，0.14 mol/L NaCl，2 mmol/L CaCl2)配制30 U/mL 凝血酶溶液，與芯片37 °C 反應1 h;依次用含0.1% (V/V)Triton X-100 的洗滌液-II(pH 7.5，20 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，0.15 mol/L NaCl)、洗滌液-II 和超純水洗滌芯片3 次，旋干。

2.2.4 酶水解過程識別 用3 μmol/L 熒光素標記的親和素與芯片37 °C 反應1 h;依次用含1%(V/V)Tween-20 不含BSA 的洗滌液-I、不含BSA 的洗滌液-I 和超純水洗滌芯片3 次，旋干;用晶芯?LuxScan10K 掃描儀進行掃描;用0.3 nmol/L 金納米粒子與芯片37 °C 反應1 h，按上述步驟洗滌芯片并旋干。

2.2.5 抑制劑檢測 將不同濃度的抑制劑分別與凝血酶溶液(30 U/mL)、加標血清(含30 U/mL 凝血酶)或血漿混合，血清或血漿的使用濃度為33%［16］。將混合溶液與芯片37 °C 反應1 h;依次用含0.1%(V/V)Triton X-100 的洗滌液-II、洗滌液-II 和超純水洗滌芯片3 次，旋干;之后的識別過程與2.2.4 節描述相同。

2.2.6 信號檢測和數據分析 用SpotWareTM芯片掃描儀提取共振光散射信號。所有數據都為扣除背景后的信號值，用6 個相同點的信號值計算平均值和標準偏差。抑制劑檢測中，不加抑制劑的子陣列作為陰性對照，定義為最小信號值Imin;不加凝血酶的子陣列作為陽性對照，定義為最大信號值Imax。子陣列的相對信號強度(Relative fuorescence/RLS intensity，ΔI)用公式(1)計算:

其中，I 為同時加入凝血酶和抑制劑的子陣列的信號值。酶溶液和加標血清中測得的IC50的差的絕對值(ΔIC50)定義為:

其中IC50，Purethrombinsolution為在酶溶液中測得的半抑制濃度，IC50，Spikedhumanserum為在加標血清中測得的半抑制濃度。

3 結果與討論

3.1 檢測原理

用文獻［16］方法將多肽點樣并固定在醛基基片表面，凝血酶水解多肽上的特異位點使多肽C 末端的生物素從芯片上解離，通過生物素和親和素之間的特異性反應，用熒光探針和金納米粒子探針標記此水解過程，熒光和共振光散射信號減弱。當加入凝血酶抑制劑時，凝血酶活性受到抑制，熒光和共振光散射信號減弱程度降低(圖1)。

圖1 基于多肽微陣列芯片的熒光法和共振光散射法檢測凝血酶抑制劑Fig.1 Schematic representation of a peptide microarray-based fluorescence and resonance light scattering (RLS)assay for detecting thrombin inhibitor

3.2 酶溶液和加標血清中抑制劑的測定

為了驗證本方法檢測抑制劑的能力，檢測了凝血酶抑制劑(阿加曲班、抗凝血酶Ⅲ和AEBSF)在酶溶液和加標血清中的IC50值。如圖2 和圖3 所示，3 種抑制劑均有效抑制了凝血酶活性，隨抑制劑濃度增加，芯片陣列的熒光信號、共振光散射信號和相對信號強度都隨之增大。凝血酶抑制劑IC50值見表1，3 種抑制劑在酶溶液中的IC50測定值均與文獻［17，18］報道相符，加標血清中測得的IC50值和酶溶液中測得的相比有一定差別。IC50值大的抑制劑，其IC50差的絕對值也較大(AEBSF ＞抗凝血酶Ⅲ＞阿加曲班)。在血清中，AEBSF 能與其它絲氨酸蛋白酶結合，抗凝血酶Ⅲ能與透明質酸結合肽酶等蛋白結合［18，19］。這種與血清蛋白的結合作用降低了抑制劑對凝血酶的抑制效率。阿加曲班幾乎不與血清蛋白結合，對凝血酶的特異性較強，抑制效率較高［20］。說明在復雜的血清環境中，對凝血酶特異性差的抑制劑，其抑制能力明顯降低。對于同一種抑制劑，由于血清蛋白對熒光素標記的生物素的非特異吸附，在純酶溶液和加標人血清中通過熒光法測得的IC50差的絕對值小于共振光散射法。說明共振光散射法能夠有效放大血清環境對抑制劑的干擾現象，較熒光法具有更高的檢測靈敏度。以上實驗結果表明，本方法不僅可以在酶溶液中，還可以在血清中定量計算抑制劑的抑制效率，考察復雜血清環境對抑制劑的影響。

表1 抑制劑IC50實驗值與文獻報道值對比Table 1 Comparison of IC50 value of this work and those from references

圖2 (a)酶溶液和(b)加標血清中共振光散射法測定的抑制劑IC50曲線圖和對應的掃描圖，掃描圖從左到右抑制劑濃度逐漸增加。阿加曲班濃度為0.0005，0.005，0.05，0.5，5，50 和500 μmol/L，抗凝血酶Ⅲ濃度為0.01，0.1，0.5，1，2.5，5，25 和100 μmol/L，4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽濃度為0.01，0.1，0.5，1，2.5，5，25，50和100 mmol/L。凝血酶濃度為30 U/mL，CAEGGfPRSFRVVK(biotin)點樣濃度為0.5 g/L。Fig.2 Half maximal inhibitory concentration (IC50)curves and the corresponding images detected by RLS assay in(a)pure thrombin and (b)spiked human serum.The concentrations of inhibitors are increased from left to right in RLS images of each array.The concentrations of argatroban are 0.0005，0.005，0.05，0.5，5，50 and 500 μmol/L，the concentrations of human antithrobin Ⅲ(HAT-Ⅲ)are 0.01，0.1，0.5，1，2.5，5，25 and 100 μmol/L，and the concentrations of 4-(2-aminoethyl)ben zenesulfonyl fluoride hydrochloride (AEBSF)are 0.01，0.1，0.5，1，2.5，5，25，50 and 100 mmol/L，respectively.The concentration of thrombin is 30 U/mL，and the concentration of CAEGGf-PRSFRVVK(biotin)in spotting solution is 0.5 g/L

圖3 (a)酶溶液和(b)加標血清中熒光法測定的抑制劑IC50曲線圖和對應的掃描圖Fig.3 IC50 curves and the corresponding images detected by fluorescent assay in (a)pure thrombin and (b)spiked human serum

3.3 血漿中抑制劑的測定

為了驗證本方法在血漿中篩選抑制劑的能力，在血漿中檢測了3 種常用凝血酶抑制劑(阿加曲班、抗凝血酶Ⅲ和AEBSF)及兩種非凝血酶的蛋白酶抑制劑(胰蛋白酶抑制劑和E-64)對凝血酶的抑制效果。胰蛋白酶抑制劑和E-64 對凝血酶沒有抑制活性［21，22］。如圖4C 所示，在抑制劑濃度均為7.5 μmol/L 的條件下，共振光散射法測得5 種化合物的抑制能力為:阿加曲班＞抗凝血酶Ⅲ＞胰蛋白酶抑制劑＞E-64 ＞AEBSF。其中，3 種凝血酶抑制劑在血漿中的抑制能力與酶溶液和加標血清中測得的IC50值大小相符，阿加曲班和抗凝血酶Ⅲ抑制能力明顯高于另外3 種化合物。雖然熒光法測得5 種化合物的抑制能力趨勢與共振光散射法一致，但其子陣列的熒光信號變化過小(圖4D)，不能滿足在血漿中明確區分各種抑制劑抑制能力的要求。對比共振光散射法的檢測結果，說明基于30 nm 金納米粒子的共振光散射檢測法，能夠有效放大實驗現象，提高檢測能力，適用于復雜血漿環境中抑制劑的篩選。

圖4 在血漿中檢測5 種化合物的掃描圖((A)，(B))和對應的數據分析圖((C)，(D))，(A)和(C)為共振光散射法檢測結果，(B)和(D)為熒光法檢測結果。從a 到g(或h 到n)分別為:活化的血漿、胰蛋白酶抑制劑、N-(反式-環氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺、4-(2-氨乙基)苯磺酰氟鹽酸鹽、阿加曲班、抗凝血酶Ⅲ和未活化的血漿。抑制劑濃度均為7.5 μmol/L，CAEGGfPRSFRVVK(biotin)點樣濃度為0.5 g/L。Fig.4 Images ((A)，(B))and the corresponding data analysis ((C)，(D))of detection of 5 compounds in human plasma.(A)，(C):The detection results of RLS assay;(B)，(D):The detection results of fluorescent assay.From a to g (or h to n):activated human plasma，trypsin inhibitor，E-64，AEBSF，argatroban，HAT-Ⅲand non-activated human plasma.The concentration of inhibitors is 7.5 μmol/L，and the concentration of CAEGGfPRSFRVVK (biotin)in spotting solution is 0.5 g/L.

3.4 血漿中抑制劑可逆性考察

為了進一步考察本方法的實用性，對阿加曲班和抗凝血酶Ⅲ在血漿中對凝血酶的抑制能力進行了檢測。用共振光散射法檢測時，隨抑制劑濃度增加抗凝血酶Ⅲ得到了近似的IC50曲線(圖5C)，而高濃度的阿加曲班并沒有完全抑制凝血酶的活性(圖5D)。抗凝血酶Ⅲ是凝血酶的不可逆抑制劑，高濃度下能夠排除血漿中凝血酶天然底物纖維蛋白原等其它物質的干擾，直接與酶活性位點作用形成不可逆的復合物，完全抑制血漿中的凝血酶活性［23］。阿加曲班是凝血酶的可逆抑制劑，結合在凝血酶與纖維蛋白原作用的活性位點，產生空間位阻效應抑制纖維蛋白原與凝血酶的結合;同樣，纖維蛋白原與凝血酶的結合也會產生空間位阻效應，抑制阿加曲班與凝血酶的結合［24］。血漿中纖維蛋白原與阿加曲班競爭結合凝血酶，因此增加阿加曲班的濃度也沒有完全抑制凝血酶的活性。雖然阿加曲班在酶溶液和加標血清中測定的IC50值均小于抗凝血酶Ⅲ，但是由于二者的抑制類型不同，抗凝血酶Ⅲ比阿加曲班在血漿中的抑制效果更好，更具有實用價值。這些實驗結果說明，基于多肽微陣列芯片的金納米粒子共振光散射檢測方法可以在血漿中區分抑制劑的類型，有助于判斷抑制劑的實際使用價值。

在血漿中用熒光法檢測時，加入不同濃度抗凝血酶Ⅲ(圖6C)和阿加曲班(圖6D)，未能有效檢測出這兩種化合物的抑制能力。以上實驗結果表明，基于多肽微陣列芯片的共振光散射檢測方法較熒光法更適于在復雜血漿環境中進行抑制劑特性考查，本方法為發展以多肽微陣列芯片為平臺的高通量藥物篩選技術打下了基礎。

圖5 在血漿中檢測抗凝血酶Ⅲ(A，C)和阿加曲班(B，D)的共振光散射掃描圖和對應的數據分析圖，a 和h 均為活化的血漿，抗凝血酶Ⅲ濃度從b 到f 分別為1，2，5，10 和20 倍半抑制濃度，阿加曲班濃度從i 到m分別為1，2，5，10 和20 倍半抑制濃度，g 和n 為未活化的血漿。半抑制濃度均采用酶溶液中的測定值。CAEGGfPRSFRVVK(biotin)點樣濃度為0.5 g/L。Fig.5 RLS images and the corresponding data analysis for detection of (A，C)HAT-Ⅲand (B，D)argatroban in human plasma.a and h are activated human plasma，the concentrations of HAT-Ⅲfrom b to f:1，2，5，10 and 20 ×IC50，the concentrations of argatroban from i to m:1，2，5，10 and 20 ×IC50，g and n are non-activated human plasma.The IC50 values are found with pure thrombin solution.The concentration of CAEGGfPRSFRVVK(biotin)in spotting solution is 0.5 g/L.

圖6 在血漿中檢測抗凝血酶Ⅲ(A，C)和阿加曲班(B，D)的熒光掃描圖和對應的數據分析圖Fig.6 Fluorescence images and the corresponding data analysis for detection of HAT-Ⅲ(A，C)and argatroban(B，D)in human plasma

1 Brummel K E，Paradis S G，Butenas S，Mann K G.Blood，2002，100(1):148 －152

2 Eriksson B I，Quinlan D J，Eikelboom J W.Annual Review of Medicine，USA:Annual Reviews，2011:62:41 －57

3 Straub A，Roehrig S，Hillisch A.Angew.Chem.Int.Ed.，2011，50(20):4574 －4590

4 Weitz J I.Thromb.Haemostasis，2010，103(1):62 －70

5 Levine M N.J.Clin.Oncol.，2009，27(29):4912 －4918

6 Mugherli L，Burchak O N，Balakireva L A，Thomas A，Chatelain F，Balakirev M Y.Angew.Chem.Int.Ed.，2009，48(41):7639 －7644

7 Fernandez L，Bleda M J，Gomara M J，Haro I.Anal.Bioanal.Chem.，2013，405(12):3973 －3982

8 Sun H Y，Chattopadhaya S，Wang J，Yao S Q.Anal.Bioanal.Chem.，2006，386(3):416 －426

9 Uttamchandani M，Lee W L，Wang J，Yao S Q.J.Am.Chem.Soc.，2007，129(43):13110 －13117

10 Uttamchandani M，Liu K，Panicker R C，Yao S Q.Chem.Comm.，2007，15:1518 －1520

11 Neumann T，Junker H D，Keil O，Burkert K，Ottleben H，Gamer J，Sekul R，Deppe H，Feurer A，Tomandl D，Metz G.Lett.Drug Des.Discov.，2005，2(8):590 －594

12 Turkevich J，Stevenson P C，Hillier J.Discuss.Faraday Soc.，1951，11:55 －75

13 Frens G.Nature，1973，241:20 －22

14 Levy R，Thanh N T K，Doty R C，Hussain I，Nichols R J，Schiffrin D J，Brust M，Fernig D G.J.Am.Chem.Soc.，2004，126(32):10076 －10084

15 Bi X Y，Lai S L，Yang K L.Anal.Chem.，2009，81(13):5503 －5509

16 Su M，Ma L，Li T，Liu D J，Wang Z X.Anal.Methods.，2013，5(21):5895 －5898

17 Berry C N，Girardot C，Lecoffre C，Lunven C.Thromb.Haemostasis，1994，72(3):381 －386

18 Liu Y.A Novel Method for the Quantitative Evaluation of Fibrinogen Coagulation［MS thesis］.Atlanta，American:Georgia State University，2009:19

19 Rawlings N D，Waller M，Barrett A J，Bateman A.Nucleic Acids Res.，2014，42(D1):D503 －509

20 Hantgan R R，Jerome W G，Hursting M.Blood，1998，92(6):2064 －2074

21 Kunitz M.J.Gen.Physiol.，1947，30(4):311 －320

22 Barrett A J，Kembhavi A A，Brown M A，Kirschke H，Knight C G，Tamai M，Hanada K.Biochem.J.，1982，201(1):189 －198

23 Olson S T，Bjork I.Semin.Thromb.Hemost.，1994，20(4):373 －409

24 Bauer M，Brandstetter H，Turk D，Sturzebecher J，Bode W.Semin.Thromb.Hemost.，1993，19(4):352 －360