索氏提取法提取裂殖壺菌粉油脂參數的優化

張憲利，張 靜，趙鳳娟，趙自國

（1.濱州學院 生命科學系，山東 濱州 256603；2.中國海洋大學 海洋生命學院，山東 青島 266003；3.山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，山東 濱州 256603）

索氏提取法提取裂殖壺菌粉油脂參數的優化

張憲利1，張 靜2，趙鳳娟3，趙自國3

（1.濱州學院 生命科學系，山東 濱州 256603；2.中國海洋大學 海洋生命學院，山東 青島 266003；3.山東省黃河三角洲野生植物資源開發利用工程技術研究中心，山東 濱州 256603）

裂殖壺菌作為富含DHA的海洋真菌成為研究熱點，但其干粉的油脂提取效率并不高，索氏提取法是能夠提高油脂得率的方法之一。通過實驗探討了兩種不同混合溶劑條件下，提取時間、藻粉量、水浴溫度等因素對新舊兩份裂殖壺菌藻粉材料油脂提取的影響，并通過正交試驗分別確定了其最佳提取條件組合：有機萃取溶劑為1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑，藻粉量1.0g，萃取時間2.5h，水浴溫度95℃，得到新、舊藻粉的最高粗油脂提取率分別為81.70%和47.43%。在最佳條件下進行重復實驗驗證，發現優化后的索提方法油脂提取率高，可以有效甄別新舊菌粉，將為裂殖壺菌油脂提取工藝的優化及實際工業應用提供實驗依據。

裂殖壺菌；油脂；索氏提取；參數優化

1 引言

裂殖壺菌（Schizochytriumsp.）俗稱裂壺藻，是一類海洋真菌，屬于真菌門（Eumycota）、卵菌綱（Oomycetes）、水霉 目 （Saprolegniales）、破 囊 壺 菌 科（Thraustochytriaceae），其形態特征為單細胞球形。裂殖壺菌目前已成為工業化生產DHA（二十二碳六烯酸，Docosahexaenoic Acid） 的 重 要 菌 種 來 源［1］。Schizochytrium細胞積累大量有用的活性物質，如：角鯊烯、色素和油脂等，其油脂含量占細胞干重的70%以上，主要由甾醇、色素等的不皂化物、極性脂和中性脂組成［2，3］，以甘油三酯為主的中性酯可占90%以上。總脂中DHA的含量高，可達35%～40%，容易分離純化，且不含魚油DHA特有的魚腥味［4］。裂殖壺菌因富含油脂尤其是DHA已經成為當前國內外研究熱點。

近年來對于裂殖壺菌的研究主要集中于菌種選育及對其培養方式的研究［5，6］、產脂肪酸的代謝機理研究［7～9］以及對其脂肪酸的提取方式的探索等方面，尤其下游油脂提取及精煉技術的研究備受關注［10，11］。綜合相關報道，油脂提取得率因原料及方法差異而呈現明顯差異；但針對特定菌種材料缺乏對具體提取工藝參數的優化研究，針對菌粉材料進行的油脂提取研究鮮有報道。索氏提取法，最早由德國農業化學家提出，已在生物油脂提取中有普遍的應用［12～14］，主要用于粗脂肪含量的測定，因其節省提取溶劑，且操作過程可控性好，具有較好的優化潛力和可行性。

本研究利用索氏提取法粗提裂殖壺菌菌粉中的脂質，并對其油脂提取參數加以優化，提出針對索氏提取真菌油脂提取方法的改良建議，從而為裂殖壺菌油脂提取工藝的優化及實際工業應用提供參考。

2 材料與方法

2.1 材料

實驗材料見表1。

表1 藻粉材料信息

2.2 儀器及試劑

儀器：N－1000旋轉蒸發儀（日本東京理化器械會社）、HH－S數顯恒溫水浴鍋（金壇市醫療儀器廠）、202－1型電熱干燥箱（濟南潔康空氣凈化設備廠）、FA1204B分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）、索氏提取器、圓底燒瓶、攪拌器、移液管、具塞試管等玻璃容器若干；

試劑：氯仿、甲醇、乙醚、石油醚、正己烷、蒸餾水；1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶液；1∶1等體積石油醚—乙醚混合溶液等。

2.3 方法

2.3.1 樣品處理

分別取一定量新、舊藻粉，裝入燒杯中，置于恒溫干燥箱中于65℃條件下烘干至恒重（標準：兩次之差＜0.0008g）。取出后置于干燥器中待用。

2.3.2 索氏提取法

具體操作流程參照相關文獻［12，14］。選擇1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶液和1∶1等體積石油醚－乙醚混合溶液兩種不同的溶劑條件下，分別控制提取時間、藻粉量、水浴溫度等變量，進行單因素實驗。根據單因素實驗的結果，通過正交試驗設計確定其油脂提取的最佳條件組合。

2.3.3 提油率的測定

采用減重法［15］。其計算公式為：

式中：P為樣品中粗脂肪的提取率（%）；m2為索氏提取前樣品濾紙筒的質量（g）；m3為索氏提取后樣品濾紙筒的質量（g）；m1為樣品菌粉中粗油脂的理論含量（g）：菌粉質量＊理論粗油脂含量。

3 結果與分析

3.1 舊藻粉在兩種不同溶劑條件下的單因素實驗

3.1.1 提取時間對粗油脂提取率的影響

不同提取時間條件下粗油脂提取率的變化較大，隨著時間的增加，提取率逐步提高。然而，1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下，當提取時間為2.5h時，其粗油脂提取率最高，提取時間達到3.0h時出現了提取率下降的現象。不同提取時間條件下，溶劑為1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下的粗油脂提取率均明顯高于1∶1石油醚—乙醚混合溶劑（圖1）。

圖1 不同提取時間對粗油脂得率的影響

3.1.2 藻粉質量對粗油脂提取率的影響

1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下，藻粉質量對粗油脂提取率的影響較大；粗油脂提取率隨著藻粉量的增加，呈現先升高后降低的趨勢；在該設定條件下，當藻粉量為1.5g時，粗油脂提取率最高；1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下的粗油脂提取率均高于1∶1石油醚—乙醚混合溶劑（圖2）。

圖2 不同藻粉量條件下索氏提取法提取的粗脂得率

3.1.3 水浴溫度對粗油脂提取率的影響

1∶1氯仿—甲醇混合溶劑條件下，粗油脂提取率伴隨水浴溫度的增加而增高，當水浴溫度設定為95℃左右時，粗油脂提取率最高（圖3）。而1∶1石油醚—乙醚混合溶劑條件下，則呈現先增加后降低的趨勢。

圖3 不同水浴溫度條件下索氏提取法提取的粗脂得率

通過各單因素實驗對比發現，1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑條件下的粗油脂提取率均優于1∶1等體積石油醚—乙醚混合溶劑，因此，后續僅設計1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑條件下的正交優化實驗。

3.2 氯仿—甲醇混合溶劑條件下舊藻粉的油脂提取正交優化實驗

在單因素實驗的基礎上，選擇藻粉量（A）、提取時間（B）和水浴溫度（C）為考察因素，進行L9（3）3正交試驗，因素水平設計見表2，正交實驗情況見表3。

表2 油脂提取條件優化正交實驗因素與水平Ⅰ

表3 舊藻粉油脂提取條件優化正交實驗Ⅱ

實驗結果表明：三個因素對裂殖壺菌粗脂得率的影響大小是：C＞B＞A，即水浴溫度的影響最大，提取時間影響其次，藻粉量的影響最小。綜合各因素考慮，最佳的油脂提取條件組合為A1＋B2＋C2，即：有機萃取溶劑為1∶1等體積氯仿－甲醇混合溶劑，藻粉量1.0g，提取時間2.5h，水浴溫度95℃時，粗油脂提取率最高。

將正交試驗獲得的粗油脂得率最佳條件組合進行重復實驗驗證，3次平行實驗得出的提油率平均值為47.43%。

3.3 氯仿—甲醇混合溶劑條件下新藻粉的油脂提取正交優化實驗

選用新藻粉，同樣進行L9（3）3正交試驗，因素水平設計參見表2，正交實驗情況見表4。

表4 新藻粉油脂提取條件優化正交實驗Ⅱ

三個因素對裂殖壺菌粗脂得率的影響大小是：C＞A＞B，即水浴溫度的影響最大，藻粉質量影響其次，提取時間的影響最小。綜合各因素考慮，最佳的油脂提取條件組合為A1＋B2＋C2，即：藻粉量1.0g左右，提取時間2.5h，水浴溫度95℃的提取條件下，粗油脂提取率最高。

將正交實驗獲得的最佳提取條件的組合進行重復實驗驗證，3次平行實驗得出的提油率平均值為81.70%。

3.4 新舊藻粉粗油脂提取率的比較

通過新舊藻粉的正交實驗，比較其各自在最佳提取條件組合下的粗油脂得率，發現新藻粉的粗油脂提取率（81.70%）明顯高于舊藻粉（47.43%）；但新舊藻粉二者的最佳提取條件組合相同。

4 結論與討論

實驗通過索氏提取方法從裂殖壺菌干藻粉提取油脂。在兩種不同的等體積混合溶劑下，分別以提取時間、藻粉量和水浴溫度為單因素控制條件，通過單因素實驗得出其粗油脂提取率，進而通過正交實驗得出最佳的油脂提取參數組合，實現對索氏提取法提取條件的優化，并將其用于藻粉鑒別。

萃取有機溶劑為1∶1等體積氯仿—甲醇混合溶劑，藻粉量1.0g左右，提取時間2.5h，水浴溫度95℃時，粗油脂提取率最高，可達81.7%，實現了對其的技術優化。當萃取有機溶劑為1∶1等體積石油醚—乙醚混合溶劑時，各項單因素實驗結果均不及前者。分析可能是該組合的沸點較低，而水浴溫度過高時容易造成乙醚的過度揮發，使混合溶劑不呈現1∶1等體積混合，對提取造成不良影響。

新舊藻粉分別在各自的最佳提取條件組合下，新藻粉的粗油脂提取率（81.70%）明顯高于舊藻粉（47.43%），可通過索氏提取比較藻粉的油脂得率來甄別新舊藻粉。分析原因可能是舊藻粉放置時間太長，加之發酵培養基不同，菌種組成可能存在差異，也可能與不同批次的菌粉添加比例不同有關。

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Optimization the Parameter of Grease Extraction From Schizochytrium Limacinum Powder Based on Soxhlet Method

Zhang Xianli1，Zhang Jing2，Zhao Fengjuan3，Zhao Ziguo3
（1.DepartmentofLifeSciences，BinzhouUniversity，Binzhou256603，China；2.CollegeofMarineLife，OceanUniversityofChina，Qingdao266003，China；3.EngineeringTechnologyResearchCenterofDevelopment andUtilizationofWildPlantResourcesinYellowRiverDeltainShandongProvince，Binzhou256603，China）

Schizochytrium has become one of the research hotspots of marine fungi for its high contents of DHA，while the oil grease extraction efficiency of schizochytrium powder is not high.The soxhlet extraction method is recognized as an effective way to improve the extraction efficiency.Under the condition of two mixed solvent，the article discusses the effect of extraction time，amount of powder and temperature on grease extraction from the new and old schizochytrium powder.In addition，the optimal extraction condition has been determined through the experiment and the orthogonal experiment.The results show that when the organic solvent is mixed by equal volume of chloroform and methanol，the amount of algae powder is 1.0g，extraction time is 2.5h，and temperature is 95℃，the extraction rate of grease is the highest，being 81.70%for new and 47.43%for old powder material.Through repeated experimental verification under the optimal condition，the article finds out that this optimized processing is effective in improving grease extraction rate and powder discrimination，which will provide useful references for grease extraction and future industrial application.

schizochytrium limacinum；grease；soxhlet extraction；parameter optimization

TS224

A

1674－9944（2015）08－0294－04

2015－06－17

國家級大學生創新訓練計劃（編號：201310449125）；山東省自然科學基金（編號：ZR2011DL012）；濱州學院科研項目（編號：2012ZDL04；BZXYFB20130706）資助

張憲利（1992—），男，山東泰安人，濱州學院生命科學系大學生。

趙鳳娟（1981—），女，山東青州人，副教授，博士，主要從事海洋生物技術研究。