茅臺醬香型酒糟中總黃酮及總多酚含量的測定

王興東，牟明月，任雅奇，許志玲，張前軍*，周清娣

（1.貴州大學 精細化工研究開發中心，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學 化學與化工學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州茅臺酒股份有限公司，貴州 仁懷 564501；4.澳大利亞悉尼大學 化學學院，澳大利亞 悉尼 1797）

酒糟是白酒產業的最大副產物，由于采用的原料、生產工藝各不相同，造成酒糟中營養成分種類與含量都各不相同[1-2]。赤水河流域醬香型酒糟是以當地生產的糯性高粱和小麥為原料，經酒曲發酵完后再蒸餾出酒后留下來的固形物，獨特原料與當地特有微生物群在整個發酵釀酒過程中發生了復雜的生物化學變化，生成多種化學成分。目前有關酒糟化學成分研究報道較少，王金華等[3]從酒糟中提取得到9.79%的水溶性戊聚糖；張世仙等[4-5]采用氣相色譜-質譜法分析茅臺醬香型酒糟的香氣成分，并探索了從茅臺醬香型酒糟中提取水溶性膳食纖維的最佳工藝條件；張云鵬等[6]對白酒糟植酸提取條件進行了優化。黃酮和多酚類化合物屬于生理活性顯著、種類繁多的天然產物，大量研究表明，黃酮和多酚類化合物具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒以及抗氧化等功效[7-8]，但迄今為止，國內很少有對酒糟總黃酮和總多酚含量測定的研究和報道。

本研究對以槲皮素為對照品，采用紫外分光光度法測定茅臺醬香型酒糟中總黃酮含量；以沒食子酸為對照品，用Folin-Ciocateu比色法測定酒糟中總多酚含量，以期建立醬香型酒糟中總黃酮及總多酚含量測定方法，為綜合利用該地區酒糟資源，開發醫藥、保健等高附加值的產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

醬香型酒糟：貴州省仁懷市茅臺鎮。

槲皮素（純度為97%）：中國藥品生物制品藥物檢定所；沒食子酸（純度為98%）：貴州迪大生物有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；硝酸鋁、鎢酸鈉、硫酸鋰：天津市科密歐化學試劑有限公司；硝酸鈉（NaNO3）、亞硝酸鈉（NaNO2）：成都金山化學試劑有限公司；氫氧化鈉：天津市永大化學試劑有限公司；鉬酸鈉：天津市化學試劑四廠；磷酸：重慶川江化學試劑廠；碳酸鈉：天津市北聯精細化學品開發有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計：上海儀電分析儀器有限公司；SB-5200D超聲波清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-52A旋轉蒸發儀、B-220恒溫水浴鍋：上海亞榮生化儀器廠；TP-114電子天平：美國丹佛儀器公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 總黃酮含量測定方法

總黃酮含量的測定采用紫外分光光度法。

（1）供試品溶液的制備

稱取干燥粉碎后的酒糟1.000 g于100 mL的圓底燒瓶中，加入50 mL體積分數75%的乙醇回流2 h，回流3次，將3次濾液合并，旋干，再用體積分數60%的乙醇溶液溶解，置于100 mL的容量瓶中，補加體積分數60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液[9]。

（2）槲皮素標準曲線制作[9]

精密稱取槲皮素標準品0.021 g，用體積分數60%的乙醇溶液定容于100 mL容量瓶中，得質量濃度為0.210 g/L的槲皮素對照品溶液。

分別取質量濃度為0.210 g/L的槲皮素標準品溶液0、2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL，置于25 mL容量瓶中，加入體積分數60%的乙醇溶液至12.5 mL，再加5%NaNO20.75 mL，搖勻，放置5 min，加入10%Al（NO3）3溶液0.75 mL，搖勻，放置5 min，加入4%NaOH溶液10 mL；分別用體積分數60%的乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min[10]。分別在波長510 nm處分別測其吸光度值，以槲皮素對照品質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。按照標準曲線回歸方程計算樣品中總黃酮的含量。

1.3.2 總多酚含量測定

總多酚含量的測定采用Folin-Ciocateu比色法。

（1）供試品溶液的制備

酒糟干燥粉碎后稱取2.000 g置于100 mL容量瓶中，加入30mL無水乙醇，加熱回流10h，抽濾后減壓濃縮成浸膏，無水乙醇溶解定容至100mL，過濾，濾液作為供試品溶液[12]。

（2）福林-酚（Folin-Ciocalteu）試劑的配制備

稱取鎢酸鈉25 g、鉬酸鈉6.25 g，然后加175 mL的水、12.5 mL的85%磷酸、25 mL的濃鹽酸，置于500 mL的圓底燒瓶中，加入沸石，加熱回流10 h，冷卻，再加硫酸鋰37.5 g、水12.5 mL和溴水適量，加熱煮沸15 min，得金黃色溶液，冷卻，過濾至250 mL的棕色容量瓶中，加水稀釋至刻度。臨用前加水一倍，搖勻[11-12]。

（3）沒食子酸標準曲線的制作對照品溶液的制備

精密稱取沒食子酸0.025 7 g，用無水乙醇溶解，轉移至100 mL棕色容量瓶中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得質量濃度為0.257 g/L的沒食子酸標準品溶液。

精密吸取質量濃度為0.257 g/L的沒食子酸標準品溶液0、0.05 mL，0.15 mL、0.25 mL、0.35 mL、0.45 mL、0.55 mL置于25 mL容量瓶中，分別加入2.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑、4mL10%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，搖勻，室溫條件下顯色80 min，分別在波長765 nm處測定吸光度值[13]，以沒食子酸對照品質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。按照標準曲線回歸方程計算樣品中總多酚的含量。

1.3.3 顯色條件的確定[12]

（1）Folin-Ciocalteu試劑加入量的確定

精密吸取質量濃度為0.257 g/L沒食子酸標準溶液0.2 mL 6份分別置于25 mL容量瓶中，分別加入（1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL）Folin-Ciocateu試劑和4.0 mL 10%Na2CO3溶液，蒸餾水定容，搖勻，在室溫條件下顯色80 min，以相應溶液為空白試劑，在波長765 nm處測定吸光度值，確定Folin-Ciocalteu試劑的最佳加入量，整個試驗過程避光操作。

（2）Na2CO3加入量的確定

精密吸取質量濃度為0.257g/L沒食子酸標準溶液0.2mL 6份分別置于25 mL容量瓶中，分別加入2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL 10%Na2CO3溶液和2.5 mL Folin-Ciocalteu試劑，蒸餾水定容，搖勻，在室溫條件下顯色80 min，以相應溶液為空白試劑，在波長765 nm處測定吸光度值，確定Na2CO3的最佳加入量，整個試驗過程避光操作。

（3）顯色時間的確定

精密吸取質量濃度為0.257g/L沒食子酸標準溶液0.2mL 6份分別置于25 mL容量瓶中，加入2.0 mL Folin-Ciocalteu試劑和4.0 mL的10%Na2CO3溶液，用蒸餾水定容，以不加入沒食子酸的為空白試劑，在室溫條件下顯色不同時間，分別在波長765nm處測定吸光度值，確定顯色的最佳時間，整個試驗過程避光操作。

2 結果與分析

2.1 槲皮素標準曲線的建立

以槲皮素質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖1。

由圖1可知，槲皮素標準曲線線性回歸方程為Y=5.234 0X＋0.005 0，相關系數R2=0.997 6，說明槲皮素對照品在0.021 0～0.105 0 g/L質量濃度范圍內與吸光度值呈良好的線性關系。

圖1 槲皮素標準曲線Fig.1 Standard curve of quercetin

2.2 沒食子酸標準曲線的建立

以沒食子酸質量濃度（X）為橫坐標，吸光度值（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，結果見圖2。

圖2 沒食子酸標準曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid

由圖2可知，沒食子酸標準曲線線性回歸方程為Y=140.00X－0.005 8，相關系數R2=0.999 7，說明沒食子酸在0.000 5～0.005 7 g/L質量濃度范圍與吸光度值呈良好的線性關系。

2.3 總黃酮測定方法學考察

2.3.1 穩定性試驗

取同一供試品溶液5.0 mL置于25 mL的容量瓶中，參照1.3.1方法配制后分別放置0、15 min、30 min、45 min、60 min后測定吸光度值，分別為0.235、0.242、0.236、0.232、0.239，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）=1.62%。供試品溶液制備后1 h內穩定，吸光度值無明顯變化。結果表明，該方法穩定性良好。

2.3.2 精密度測定

取同一供試品溶液5.0 mL 5份，參照1.3.1方法配制后以不加供試品的相應溶液作為空白試劑，測定其吸光度值，分別為0.205、0.203、0.213、0.206、0.208，RSD=1.84%。結果表明，該方法精密度良好。

2.3.3 重復性試驗

稱取同一批干燥粉碎后的酒糟5份，每份1.000 g，按照1.3.1操作制備供試品溶液，取其5.0 mL供試品溶液置于25 mL的容量瓶中，測定其吸光度值，結果分別為0.211、0.222、0.202、0.223、0.235，RSD=5.76%。結果表明，該方法重復性良好。

2.3.4 加標回收率試驗

稱取同一批干燥粉碎后的酒糟5份，每份0.500 0 g，置于100 mL的圓底燒瓶中，按照1.3.1的方法制成供試品溶液，精密加入對照品適量，測定吸光度值并計算回收率，結果見表1。

表1 總黃酮測定加標回收率試驗結果Table 1 Results of adding standard recovery rate tests for total flavonoids determination

由表1可知，酒糟中總黃酮的回收率為98.37%～100.02%，平均回收率為99.12%，相對標準偏差為0.61%，說明該方法的準確度較好，能滿足酒糟中總黃酮的檢測要求。

2.4 福林酚法顯色條件的確定

2.4.1 試劑加入量的確定

圖3 Folin-Ciocalteu試劑加入量對吸光度值的影響Fig.3 Effect of Folin-Ciocalteu reagent addition on absorbance value

由圖3可知，隨Folin-Ciocalteu試劑的加入量的增加，吸光度值先下降后上升，最后下降，這可能是由于酒糟乙醇溶液本身呈黃色，隨著Folin-Ciocalteu試劑的加入，W+6與體系中酚羥基作用還原成藍色W+5，與酒糟溶液顏色產生消減，吸光度值降低，當Folin-Ciocalteu試劑加到最大量后，體系中的酚羥基作用完全形成深藍色復合物，吸光度值達到最大值。當Folin-Ciocalteu試劑體積為2.0 mL時吸光度值到達最低，為0.271；當Folin-Ciocalteu試劑體積為2.5 mL時吸光度值到達最高，為0.284。因此，選擇Folin-Ciocalteu試劑最佳加入量為2.5 mL。

圖4 10%Na2CO3加入量對多酚含量的影響Fig.4 Effect of 10%Na2CO3addition on absorbance value

2.4.2 Na2CO3加入量的確定光度值，結果分別為0.323、0.322、0.323、0.323、0.323，RSD=0.138%，可以看出在顯色80 min后的40 min內吸光度值變化不大，說明該方法穩定性良好。

2.5.3 重復性實驗

重復1.3.2方法制備供試品溶液。精密吸取0.6 mL供試品溶液，依照1.3.2方法測定吸光度值，結果分別為0.316、0.306、0.308、0.323、0.320，RSD=2.35%，結果表明，該方法重復性良好。

2.5.4 加標回收率試驗

稱取同一批酒糟5份，每份1.000 g左右，依照1.3.2方法制備供試品。精密加入對照品適量，參照1.3.2方法測定吸光度值并計算回收率，結果見表2。

由圖4可知，隨著Na2CO3溶液加入量的增加，總多酚含量也隨之增加，當10%Na2CO3體積為5.0 mL時，吸光度值為最大。之后稍有下降，因此，選擇10%Na2CO3溶液的最佳加入量為5.0 mL。

2.4.3 顯色時間的確定

表2 總多酚測定加標回收率實驗結果Table 2 Result of adding standard recovery rate tests for total polyphenol determination

圖5 顯色時間對吸光度值的影響Fig.5 Effect of reaction time on absorbance value

由圖5可知，隨著顯色時間的延長，吸光度值呈上升趨勢，說明多酚含量也逐漸增加。當顯色時間為80 min時，吸光度值最大，之后隨著顯色時間的增長吸光度值趨于平緩，因此選擇顯色時間為80 min。

2.5 多酚測定方法學考察[14-15]

2.5.1 精密度試驗

精密吸取同一供試品溶液5份0.6 mL分別置于25 mL容量瓶中，參照1.3.2方法測定吸光度值，結果分別為0.318、0.316、0.319、0.317、0.317，RSD=0.359%。結果表明，該方法精密度良好。

2.5.2 穩定性實驗

精密吸取0.6 mL供試品溶液至25 mL容量瓶中，參照1.3.2方法配制后在波長765 nm處每隔10 min測定一次吸

由表2可知，測定酒糟中總多酚的加標回收率為99.40%～100.31%，平均加標回收率為99.82%，檢測結果相對標準偏差為0.33%，說明該方法具有良好的準確性，能滿足酒糟中總多酚的檢測要求。

3 結論

本實驗分別以槲皮素和沒食子酸為標準品，建立了測定酒糟中黃酮和多酚含量的紫外分光光度法和Folin-Ciocalteu比色法，確定了Folin-Ciocalteu比色法最優的測定條件：加入Folin-Ciocalteu試劑2.5 mL、10%Na2CO3溶液4 mL，室溫下顯色80 min。結果表明，茅臺醬香型酒糟中總黃酮含量為20.40 mg/g，總多酚含量為4.78 mg/g。總黃酮及總多酚分別在0.021 0～0.105 0 g/L（R2=0.997 6）和0.000 51～0.005 765 g/L（R2=0.999 7）與吸光度值線性關系良好，平均回收率分別為99.12%、99.82%，相對標準偏差（RSD）分別為0.609%、0.33%。本方法操作簡單，結果準確可靠，穩定性和重復性良好，適用于醬香型酒糟中黃酮和多酚的定量測定。茅臺醬香型酒糟中具有一定含量的黃酮和多酚類化合物，具有醫藥、化學品、食品等方面的開發前景，為酒糟的深度開發利用提供了參考價值。

[1]譚之磊，劉建輝，馬 凱，等.白酒糟綜合利用新技術[J].廣東化工，2015，42（7）：72-73.

[2]李 建，葉 翔.酒糟綜合利用多元化研究[J].中國釀造，2013，32（12）：121-124.

[3]王金華，李東生，陳 雄.啤酒糟中水溶性戊聚糖的提取及純化[J].食品工業，2003（4）：10-12.

[4]張世仙，金 茜，曾啟華，等.茅臺醬香型酒糟香氣成分分析[J].中國釀造，2012，31（1）：188-189.

[5]張世仙，張素英，曾啟華，等.堿法提取茅臺酒糟中水溶性膳食纖維的工藝研究[J].中國釀造，2011，30（10）：126-128.

[6]張云鵬，劉 軍，陳 娟.白酒糟植酸提取條件的優化[J].中國釀造，2010，3（4）：125-127.

[7]龐道睿，劉 凡.廖森泰，等.植物源多酚類化合物活性研究進展及其應用[J].廣東農業科學，2013，40（4）：91-94.

[8]延 璽，劉會青，鄒永青，等.黃酮類化合物生理活性及合成研究進展[J].有機化學，2008，28（9）：1534-1544.

[9]羅 蘭，郭麗冰，曾長青.大山楂丸中總黃酮的含量測定[J].時珍國醫國藥，2007，18（9）：2207-2208.

[10]董 玉，王愛民，陳朝軍，等.文冠木中總黃酮的含量測定方法研究[J].蒙醫藥論壇，2008，30（5）：364.

[11]李 杰，趙聲蘭，陳朝銀.Folin-Ciocalteu比色法測定核桃青皮果蔬酵素總多酚含量[J].中國釀造，2015，34（9）：130-134.

[12]吳曉青，陳 丹，邱紅鑫，等.芙蓉李中總多酚含量測定方法的優選[J].中國中醫藥科技，2011，2（18）：131-133.

[13]陳 晨，文懷秀，羅智敏，等.白刺色素和黑果枸杞色素中花色苷與總多酚的測定[J].光譜實驗室，2010，5（27）：1796-1798.

[14]李文仙，俞 丹，林 玲，等.Folin-Ciocalteu比色法應用于蔬菜和水果總多酚含量測定的研究[J].營養學報，2011，3（33）：302-307.

[15]任 飛，杜宏濤，張繼文，等.柿子皮提取物中多酚含量及其抗氧活性[J].西北農業學報，2011，20（4）：144-147.