噬菌體展示技術篩選小細胞肺癌細胞特異性結合多肽

梁 珍 姜 堯 石姣姣 侯春英 張 蕊 楊 楠 劉雁勇 左萍萍

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噬菌體展示技術篩選小細胞肺癌細胞特異性結合多肽

梁 珍 姜 堯 石姣姣 侯春英 張 蕊 楊 楠 劉雁勇 左萍萍

目的 利用噬菌體七肽庫，篩選出與小細胞肺癌細胞系H446細胞特異性結合的多肽。方法 利用噬菌體展示技術和小細胞肺癌細胞系H446細胞，經過多次3輪篩選，每次挑取12個噬菌體單克隆進行DNA測序，分析得到多肽序列，并利用免疫組織化學技術驗證多肽的特異性。結果 多肽AF(AGALHQF)與小細胞肺癌病理組織有較高的親和性。結論 噬菌體展示技術篩選的多肽AF可望為小細胞肺癌靶向治療提供新的方向。

小細胞肺癌 噬菌體展示技術 多肽

小細胞肺癌是肺癌中惡性程度最高的腫瘤之一，每年15%腫瘤患者被確診為小細胞肺癌[1]。因其倍增時間短，轉移早而廣泛，對化療、放療敏感，初治緩解率高，但極易發生繼發性耐藥，容易復發，故患者5年生存率極低，僅為12%[2,3]。化療是治療小細胞肺癌的基石，但大部分化療由于藥物特異性差，而出現骨髓抑制、嘔吐等不良反應[4]。隨著靶向治療的出現，一些針對于小細胞肺癌生物學特征的靶向藥物已經應用于臨床，像基質金屬蛋白酶抑制劑、沙利度胺等。但是，理想的治療效果鮮少報道[5]。因此，尋找特異性強、敏感度高的靶分子顯得尤其重要。

本研究主要以小細胞肺癌細胞系H446為靶分子，利用7肽噬菌體庫進行體外篩選，從而獲得小細胞肺癌細胞H446特異性結合的多肽，以期為小細胞肺癌靶向治療提供新的策略。

材料與方法

1.材料: Ph.D.-7TM噬菌體展示肽庫試劑盒(New England Biolabs公司，美國)。小細胞肺癌細胞系H446(中國醫學科學院腫瘤醫院，中國)。RPMI1640培養基和0.25%胰酶(中國醫學科學院, 北京)。鏈霉素-FITC 和鏈霉素(Sigma公司, 上海)。DAPI和抗熒光衰減封片劑(中山金橋公司, 北京)。

2.方法: (1)細胞培養: 人小細胞肺癌細胞系H446細胞用含10%胎牛血清的RPMI1640培養基，在37℃恒溫，5%CO2，飽和濕度培養箱中培養。當細胞80%匯合時，進行傳代。(2)特異性篩選: 消化、收集H446細胞，離心，棄上清，PBS洗3次。封閉緩沖液重懸細胞，4℃作用1h，離心，棄上清。然后，噬菌體肽庫重懸細胞，室溫下作用1h。TBST洗去未結合的噬菌體。之后，用洗脫緩沖液重懸細胞，室溫下作用15min，離心，留上清，此即未擴增的噬菌體。然后，將噬菌體擴增，純化，測效價，再進行下一輪淘選。(3) DNA測序: 取第3輪未擴增的噬菌體鋪至IPTG/X-gal平板，隨機挑選12個藍斑進行擴增，提取噬菌體DNA，此即為噬菌體DNA模板。取適量模板進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察有無DNA條帶，將觀察到DNA條帶的模板送至上海英俊進行測序。根據DNA序列推導出多肽序列。(4) 多肽特異性驗證: 將出現次數最多的4個多肽序列委托上海吉爾生化公司進行合成，并將N端進行生物素標記。分別取人正常心、肝、脾、肺、腎正常組織及小細胞肺癌臨床患者病理組織石蠟切片，將其脫蠟至水。25μg/ml鏈霉素中和內源性生物素，室溫下將肽(1mg/ml, 稀釋為1∶200)分別于各組織孵育1h。然后與FITC標記的鏈霉素(1mg/ml, 稀釋為1∶100)室溫下作用1h。DAPI和抗熒光衰減封片劑封片。熒光顯微鏡下觀察結合情況。

結 果

1.特異性篩選：以小細胞肺癌細胞H446 為靶細胞，對Ph.D.-7TM 噬菌體展示肽庫進行多次3輪篩選，1、2輪淘選效價測試為1011pfu/ml，均符合要求，3輪淘選為防止產生偏噬，不需擴增，直接提取測序，可得到與小細胞肺癌細胞H446特異性結合的噬菌體。圖1為3輪洗脫物藍斑照片。

圖1 噬菌體展示3輪淘選洗脫物藍斑

2.DNA提取：將提取到的DNA模板進行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察發現大部分模板均出現條帶(圖2)，說明出現的藍斑都含有DNA。

圖2 DNA模板在瓊脂糖凝膠中電泳情況

3.DNA序列測定：將瓊脂糖凝膠中出現條帶的DNA模板測序，結果顯示噬菌體克隆中出現多種氨基酸序列，其中展示如下4種氨基酸序列的噬菌體被富集(表1)。

表1 噬菌體克隆序列分析

4.肽特異性驗證：小細胞肺癌臨床患者腫瘤組織和人心、肝、脾、肺、腎正常組織石蠟切片與各多肽孵育，熒光顯微鏡下觀察結合情況。多肽AF與腫瘤組織顯著性結合，而與正常組織極少結合，顯著優于其他多肽，另外3個多肽與正常組織部分結合，詳見圖3。

圖3 肽AF與小細胞肺癌臨床患者腫瘤組織和人心、肝、脾、肺、腎正常組織結合情況A.SCLC腫瘤組織；B.心；C.肝；D.脾；E.肺；F.腎

尋找特異性強的靶分子，進而實現針對性的靶向治療是現今腫瘤治療的一個趨勢。而低分子多肽，因其相對分子質量小，結構簡單，穿透性強，免疫誘導弱，而越來越廣泛作為靶向載體被人熟知[6]。以腫瘤組織某些異常表達的分子為靶分子，篩選出能與其特異性結合的低分子活性肽段，利用氨基酸分子的某些基團連接到藥物上，從而提高療效，降低毒性不良反應[7,8]。

噬菌體展示技術，自Smith創建以來，日益完善。在分離特異性與靶分子結合的多肽或抗體方面表現出強大的潛力。尤其是當靶分子為細胞時，這種分離的有效性較已知靶分子大大增加。因為細胞表面的結構很復雜，這樣有利于篩選出共有序列[9,10]。已經有研究者利用這一技術得到特異性結合的肽或抗體。Jun等[11]利用噬菌體展示獲得的肽所制備的靶向藥物更好地被腫瘤細胞攝取。基于此，噬菌體展示技術目前廣泛應用于各腫瘤的靶向研究中。

然而，噬菌體展示技術面臨的挑戰是所篩選出來的靶分子特異性不夠強，最大限度地減少非特異性結合，而同時提高噬菌體的富集始終是改進這項技術的目標。目前，有研究者通過體內篩選，從而最大限度地還原腫瘤生長的環境[12]；更有研究者利用干細胞作為靶分子，以提高靶分子的特異性，從而改善了藥物的體內分布情況[13]。

本研究初步鑒定肽AF與小細胞肺癌細胞系H446細胞具有較強的親和力，同時發現其能與小細胞肺癌病理組織強特異性地結合。此發現表明可能篩選到一種新的小細胞肺癌相關抗原的配體。這將為靶向藥物的制備提供新的靶分子，制備特異性更好的靶向藥物。

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(修回日期：2015-03-20)

Screening of Small Cell Lung Cancer Cells Specific Polypeptide from a Phage Display Peptide Library.

LiangZhen,JiangYao,ShiJiaojiao,etal.

DepartmentofPharmacology,InstituteofBasicMedicalSciences,ChineseAcademyofMedicalSciences&SchoolofBasicMedicine,PekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China

Objective To obtain the polypeptides, which specifically recognize small cell lung cancer cells (SCLCs) from peptide libraries. Methods After several times of three rounds of biopanning by applying phage display technology in SCLCs H446 cells, we selected twelve clones to extract DNA, and then these DNA were sequenced and deduced to amine acid sequence. Immunohistochemical method was used to identify the specificity of these polypeptides. Results Polypeptide AF specifically recognized SCLC tissue section. Conclusion Polypeptides AF, obtained by phage displayed technology, potentially provides new strategy in the targeting treatment of small cell lung cancer.

Small cell lung cancer (SCLC)；Phage displayed technology；Polypeptides

國家重點基礎發展計劃項目(“973”計劃項目)(2010CB934002)

100005 中國醫學科學院基礎醫學研究所/北京協和醫學院基礎學院藥理室

左萍萍，教授，電子信箱：zuopp@126.com

R9

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.007

2015-03-02)