豬瘟活疫苗效力檢驗替代方法的研究

王海光，寧宜寶?，賴月輝，吳文福，王芳，劉燦，張文利，黃秋雪，陳堅，林旭埜，張毓金，范學政，徐璐，王琴，趙啟祖，丁家波

（1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州511356）

豬瘟活疫苗效力檢驗替代方法的研究

王海光1，寧宜寶1?，賴月輝2，吳文福2，王芳1，劉燦1，張文利1，黃秋雪2，陳堅2，林旭埜2，張毓金2，范學政1，徐璐1，王琴1，趙啟祖1，丁家波1

（1.中國獸醫藥品監察所，北京100081；2.廣東永順生物制藥股份有限公司，廣州511356）

目前，我國豬瘟活疫苗效力檢驗最常用的方法是測定豬瘟疫苗中病毒的兔體感染量（RID），但是用該方法易受到檢驗兔品種、個體和飼養環境的影響。為了探索一種不依賴動物的疫苗效力檢驗新方法，本研究將待檢豬瘟活疫苗系列稀釋后分別接種易感細胞，使用抗原捕獲ELISA、RT-nestPCR和RT-PCR三種方法檢測不同稀釋度疫苗中活病毒在感染細胞后增殖的子代病毒，計算疫苗病毒的最高細胞感染劑量，建立了豬瘟疫苗病毒的細胞感染量（CID）的效力檢驗方法。結果顯示：疫苗中活病毒粒子越多，CID就越高；對不同類型豬瘟疫苗的檢測結果表明，該方法適用于傳代細胞源和細胞源豬瘟活疫苗的效力效檢。使用CID和RID兩種檢測方法同時對12批豬睪丸傳代細胞源（傳代細胞源）和3批牛睪丸原代細胞源（細胞源）豬瘟活疫苗進行了比對效檢，結果表明，用CID測定方法檢驗，12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）每頭份均含105CID，3批豬瘟活疫苗（細胞源）每頭份含量均為104CID；用兔子感染體溫測定法，12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）每頭份含量在2.6×104～3.0×104RID之間，3批豬瘟活疫苗（細胞源）每頭份含7.0×103～8.0×103RID。試驗證明：本實驗室建立的CID檢測結果與現有質量標準RID的結果存在良好的相關性，能夠較好反映疫苗中活病毒的含量，有望成為RID的替代方法。

豬瘟活疫苗；效力檢驗；替代方法；兔體感染量；細胞感染量；抗原捕獲ELISA；RT-nestPCR；RT-PCR

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）引起的一種豬的烈性、急性傳染性疾病，我國將其列為一類動物傳染病。我國培育的豬瘟兔化弱毒疫苗是國際上公認最安全、有效的豬瘟疫苗之一，為我國乃至世界豬瘟的防控和消滅起到了重要的作用［1-2］。為了保證豬瘟活疫苗安全有效，疫苗的效力檢驗方法顯得尤為重要。到目前為止，我國豬瘟兔化弱毒疫苗效力檢驗方法一直是延用20世紀50年代建立的兔體感染量測定法［3］。由于不同品種、不同個體的試驗兔對豬瘟兔化弱毒的敏感性存在差異［4］，同批豬瘟疫苗用不同品種的兔在不同地區進行效力檢驗，有時會出現不同的結果，用兔子進行豬瘟疫苗效力檢驗存在費時、費力，可重復性差等缺點，因此建立不依賴動物的效力檢驗替代方法是勢在必行。豬瘟活疫苗對宿主的免疫效力是通過病毒感染宿主細胞激活免疫系統而實現的，在一定范圍內，宿主免疫疫苗的病毒量越大，對宿主免疫系統的激活就越強，免疫效力就越好［5］。因此，豬瘟兔化弱毒疫苗的免疫效力可以通過測定疫苗中有細胞感染性活病毒的量（濃度）來評價。鐘明華等曾報道用新城疫病毒增強豬瘟病毒的致細胞病變來測定豬瘟疫苗的活病毒滴度替代動物效力檢驗的方法，但由于該方法致細胞病變不穩定未能推廣使用。本試驗旨在建立一種能夠客觀準確檢測豬瘟疫苗中活病毒含量的效力檢驗替代方法。

1 材料與方法

1.1 豬瘟疫苗凍干制品和豬瘟細胞毒濕毒

1.1.1 監督抽檢豬瘟疫苗 14批豬瘟活疫苗，為中國獸醫藥品監察所從5個豬瘟疫苗生產企業監督抽檢獲得。其中豬瘟活疫苗（傳代細胞源）4批，批號分別為201202、201209、201210和201211；豬瘟活疫苗（細胞源）3批，批號為：201212、201213和201203批；豬瘟活疫苗（脾淋源）7批，批號為：201201、201204、201205、201206、201207、201208和201214批，所有疫苗均在有效期內。

1.1.2 豬瘟兔化弱毒細胞液濕毒 不同代次收獲的豬瘟兔化弱毒細胞毒，由廣東永順生物制藥股份有限公司制備和提供。

1.1.3 RID與CID測定法比較檢測用豬瘟活疫苗12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源），批次分別為：ST2012036、ST2012037、ST2012038、ST2012041、ST2012042、ST2012043、ST2012044、ST2012046、ST2012047、ST2011054、ST2011055和ST2011056；3批豬瘟活疫苗（細胞源），批次分別為：2012124、2012125和2012126。以上疫苗均由廣東永順生物制藥股份有限公司提供，所有疫苗均在有效期內。

1.2 細胞及試驗動物

1.2.1 ST傳代細胞 由中國獸醫藥品監察所和廣東永順生物制藥有限公司提供。

1.2.2 豬瘟抗原捕獲ELISA檢測試劑盒 購自美國IDEXX公司。

1.2.3 豬瘟RT-PCR檢測試劑盒 購于北京世紀元亨動物防疫技術有限公司。

1.2.4 RT-nestPCR檢測方法 本實驗室自建［2］。

1.2.5 兔 新西蘭大耳白兔，體重1.5～3.0 kg，由廣東永順生物制藥有限公司自繁自養。

1.2.6 RID測定 按2010版《中國獸藥典》規定的方法測定［3］。

1.3 體外CID檢測方法的建立

1.3.1 細胞培養、病毒接種和樣品收獲

1.3.1.1 細胞準備 細胞營養液：取90 mL MEM（Invitrogen）培養液，加入10 mL新生牛血清（Invitrogen），4℃保存。細胞維持液：取97 mL MEM，加入3 mL新生牛血清，4℃保存。取生長良好單層的ST細胞瓶，用胰酶消化后，再用營養培養液配制成每毫升含1×106個細胞的細胞懸液，接種于25 cm2細胞瓶中，每瓶6 mL，于37℃、5%CO2條件下培養24～36 h，當細胞長成良好單層后備用。

1.3.1.2 病毒接種和樣品收獲 棄去細胞培養板中的上清液，將每頭份豬瘟兔化弱毒濕毒稀釋成10-1～10-6，每個稀釋度分別接種于4瓶長成良好ST細胞單層的25 cm2細胞瓶，每瓶0.6 mL，留4瓶細胞不接種病毒作為空白對照，置于37℃、5% CO2溫箱中吸附4 h后，吸出毒液，每瓶加入6 mL維持液，繼續培養。每4 d收一次毒，將上清液混合，另每次從每個稀釋度病毒液接種的4個細胞瓶中取出一瓶，吸出一半細胞上清，另一半留下連同細胞一起置于-20℃凍溶兩次以裂解細胞，以比較細胞上清液和細胞內的豬瘟病毒含量。共收獲4次。1.3.2 抗原捕獲ELISA檢測法對待檢抗原最佳收獲代次、最高陽性稀釋度和處理方式的比較 按豬瘟抗原捕獲ELISA檢測試劑盒說明書的操作程序對豬瘟疫苗進行檢測。將檢測樣品分成兩組，一種按裂解液與樣品原液1∶1的比例混合裂解處理，一組不加裂解液處理，比較裂解液處理樣品對檢測結果的影響；用ELISA分別測定各稀釋度毒液接種細胞后1～4收次樣品中的豬瘟病毒，按試劑盒說明書標準判定檢測結果。以確定檢驗的疫苗樣品最佳收獲時間和最高稀釋度。

1.3.3 不同類型豬瘟疫苗的比較檢測 采用抗原捕獲ELISA對14批3種不同類型的豬瘟疫苗成品進行檢驗，以確定該效檢方法適用檢測疫苗的類型。細胞培養、收毒和檢測操作流程同1.3.1和1.3.2。

1.3.4 幾種CID測毒方法的比較檢測 采用抗原捕獲ELISA、RT-PCR和RT-nestPCR方法對疫苗接種ST細胞后不同時間收集的樣品進行檢測，將檢測結果進行比較。

1.4 CID與RID檢測結果的比較 用細胞維持液將12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）和3批豬瘟活疫苗（細胞源）稀釋成10-1～10-6，取疫苗10-3～10-6每個稀釋度各0.6 mL接種1瓶細胞，吸附4 h后，吸出病毒液，按6 mL／瓶加入維持液，繼續在37℃、5%CO2條件下培養。每4 d收獲細胞上清液1次，連續收獲3次。采用豬瘟抗原捕獲ELISA試劑盒對所有樣品進行檢測，并用豬瘟RT-nestPCR和RT-PCR檢測試劑盒進行確認。同時，對同一批次的疫苗按2010年版《中國獸藥典》規定的兔體檢測方法測定每批疫苗每頭份中的RID含量，并與CID方法檢測得到的結果進行比對。

2 結果

2.1 CID測定法對不同時間收獲豬瘟病毒濕毒樣品的檢測結果 豬瘟抗原捕獲ELISA對不同稀釋度豬瘟兔化弱毒接種ST細胞后不同時間細胞病毒感染的測定結果見表1。

表1結果表明：不同稀釋度豬瘟病毒接種細胞后第4天，僅在10-3和10-4稀釋度病毒液接種的細胞中檢測到豬瘟病毒，第8天時，可以在10-5和10-6稀釋度病毒液接種的細胞中檢測到豬瘟病毒，第12天可以在10-6稀釋度病毒液接種的所有細胞中檢測到豬瘟病毒，12 d與16 d收獲樣品的結果沒有差異；結果證明接種12 d，細胞中豬瘟病毒增殖已達高峰；細胞內和細胞上清中豬瘟病毒含量沒有明顯差異，這與早期報道的結果基本相一致［6］；檢測樣品用裂解液處理在早期似乎能提高檢測陽性水平，但對12 d收集的樣品，不影響抗原捕獲ELISA的檢測結果；用RT-nestPCR的檢測，在接毒后第4天就能在10-6稀釋度病毒液接種收獲的ST細胞上清中檢測到豬瘟病毒核酸，這一點與ELISA方法不一致；結果同時顯示，用豬瘟抗原捕獲ELISA檢測為“可疑”的12 d以上收獲的病毒樣品，用RT-nestPCR的檢測結果均為陰性，證明這種可疑反應為非特異性反應。因此，在最終判定結果時，ELISA檢測結果“可疑”的樣品一律視為陰性。

2.2 CID測定方法對不同種類疫苗的檢測結果按所建立的抗原捕獲ELISA操作流程對14批不同廠家生產的豬瘟活疫苗（傳代細胞源）、豬瘟活疫苗（細胞源）、豬瘟活疫苗（兔脾淋源）三種類型的豬瘟活疫苗進行活病毒測定，結果見表2。

表1 不同稀釋度豬瘟兔化弱毒濕毒接種細胞后第4～16天收獲樣品的病毒檢測結果

表2 不同類型疫苗接種細胞后不同時間所收獲細胞上清樣品的豬瘟抗原捕獲ELISA檢測結果

續表

表2結果表明：同表1顯示的結果一樣，稀釋病毒樣品接種后12天，病毒達到增殖高峰，以12天收獲細胞上清的檢測結果作為判定標準，將4批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）每頭份稀釋到10-5接種的ST細胞，均可檢測到豬瘟病毒；3批豬瘟活疫苗（細胞源）只有稀釋10-4／頭份接種的細胞上清能檢測到豬瘟病毒，病毒含量比豬瘟活疫苗（傳代細胞源）的CID低10倍。而7批豬瘟活疫苗（兔源）所有稀釋度接種的細胞都沒有檢測到豬瘟病毒。由此可見，豬瘟活疫苗（傳代細胞源）和豬瘟活疫苗（細胞源）適于使用CID替代方法進行效檢，而在所有稀釋度豬瘟活疫苗（兔源）接種的細胞上清液中均沒有檢測到豬瘟病毒，是方法問題，還是疫苗質量問題，還有待進一步研究。

2.3 細胞感染量與兔體定型熱對豬瘟成品疫苗的比較檢測結果 將廣東永順生物制藥股份有限公司生產的12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）和3批豬瘟活疫苗（細胞源）用CID和RID測定法進行比較檢測，結果見表3。

表3結果表明：抗原捕獲ELISA、RT-nestPCR和RT-PCR 3種方法對15批疫苗細胞感染毒量檢測結果完全一致；用3種方法檢測感染細胞上清液，所有12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）的病毒含量均為105CID／頭份，3批豬瘟活疫苗（細胞源）每頭份均為104CID；用兔檢測，12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）每頭份中的病毒含量均在2.6×104～3.0×104RID之間，3批豬瘟活疫苗（細胞源）每頭份含在7.0×103～8.0×103RID之間。

考慮到豬瘟活疫苗（傳代細胞源）的規程標準為每頭份≥7500 RID，根據此次豬瘟活疫苗（傳代細胞源）體外活病毒含量測定其陽性稀釋度均能夠達到105CID／頭份的檢測結果，初步可將體外動物替代方法活病毒含量檢測的質量合格標準定為疫苗稀釋度≥104.5CID／頭份檢測陽性為合格。

表3 效檢替代方法與兔體定型熱法檢測結果

3 討論

豬瘟兔化弱毒可以在多種細胞上生長，但均不產生細胞病變（CPE），因此無法通過直接觀察感染細胞的CPE來判定疫苗中豬瘟病毒的細胞感染量。本實驗室建立的用稀釋后的豬瘟疫苗接種細胞，使用特異敏感的方法來測定細胞上清液中的病毒。多次試驗證明：該方法客觀準確，特異性強，敏感性高，有效克服了兔子品種和飼養環境對豬瘟疫苗檢測結果的影響，這是本研究的一個重大突破。

在病毒接種細胞后的早期檢測中，雖然ELISA的檢測方法沒有檢測到病毒，而RT-nestPCR檢測到了，但試驗同時證明，只有到病毒增殖到足夠量時，ELISA才能檢測到陽性結果，這證明ELISA方法檢測到的病毒是接種后的增殖到一定量的子代豬瘟病毒，因此在使用ELISA對豬瘟兔化弱毒疫苗進行效檢時，應采用接種病毒后10～12 d收獲的細胞上清液進行檢測。RT-nestPCR檢出細胞中豬瘟病毒的時間比ELISA早得多，一方面是前者的敏感性比后者要高，另一方面是因為該方法檢測的病毒基因，不能區別死毒與活毒，4 d時在10-6疫苗接種的細胞上清中檢測的病毒核酸有可能是早期接種到細胞中尚未增殖的病毒，而疫苗效力檢驗是要檢測活的有感染性的豬瘟病毒，所以RT-nestPCR早期的檢測病毒核酸結果只能作為參考［7-8］。

從細胞感染量與兔體定型熱對12批豬瘟活疫苗（傳代細胞源）比較檢測得到的結果來看，兩種方法存在良好的對應關系，檢測陽性滴度均為105，引起細胞感染與引起兔產生定型熱的豬瘟病毒含量基本是一致的。但是本試驗中所測定的疫苗批次還比較少，應增加不同企業利用同一種方法對多批疫苗的比較檢測，以得到一個更加準確的疫苗質量臨界判定值。

7批豬瘟活疫苗（兔脾淋源）的所有稀釋度毒液接種的ST細胞4～16 d收獲的細胞上清液中均沒有檢測到豬瘟病毒抗原，有可能是疫苗質量問題，也有可能是用兔脾臟、淋巴結組織對ST細胞的病毒增殖能力有干擾抑制作用。因為表2的結果顯示，有兩批豬瘟活疫苗（兔源）用10-1稀釋度接種細胞后4 d可見到ST細胞脫落死亡的現象。到底是方法問題，還是疫苗質量問題，有待進一步做深入研究。

［1］ 寧宜寶.獸用疫苗學［M］.北京：中國農業出版社，2009.

［2］ Wang H，Ning Y，Ying C，et al.Development and application of a RT-nestPCR assay for differential detection of c-strain and wild-type viruses of classical swine fever virus［J］.Sustainable Agriculture Research，2013，2：27.

［3］ 中華人民共和國獸藥典［S］.北京：中國農業出版社，2010.

［4］ 曾彥欽，吳潤生，林志坤，等.酷暑對兔體溫和豬瘟定型熱比率的影響［J］.福建農業學報，2007，22（3）：283-287.

［5］ van Oirschot J T.Vaccinology of classical swine fever：from lab to field［J］.Veterinary Microbiology，2003，96（4）：367-384.

［6］ Keelapang P，Sriburi R，Supasa S，et al.Alterations of pr-M cleavage and virus export in pr-M junction chimeric dengue viruses［J］.J Virol，2004，78（5）：2367-2381.

［7］ 陳玉棟，張楚瑜，鄒俊煊，等.建立快速定量檢測豬瘟兔化弱毒苗的熒光定量PCR技術［J］.中國病毒學，2003，18（2）：124-128.

［8］ 陳鍇，姚華偉，王長江，等.熒光定量PCR作為豬瘟兔化弱毒疫苗效價檢驗替代方法的研究與應用［J］.中國農業科學，2013，46（1）：162-169.

（編輯：李文平）

WANG Hai-guang1，NING Yi-bao1?，LAI Yue-hui2，WU Wen-fu2，WANG Fang1，LIU Can1，ZHANG Wen-li1，HUANG Qiu-xue2，CHEN Jian2，LIN Xu-ye2，ZHANG Yu-jin2，FAN Xue-zheng1，XU Lu1，WANG Qin1，ZHAO Qi-zu1，DING Jia-bo1
（1.China Institute of Veterinary Drug Control，Beijing 100081，China；2.Guangdong Win-sun Bio-pharmaceutical Co.Ltd，Guangzhou 511356，China）

classical swine live vaccine；potency test；alternative strategy；CID；RID；ELISA；RT-nestPCR；RT-PCR

2015-02-01

A

1002-1280（2015）03-0001-06

S859.79

農業部“948”項目（2011-G4）

王海光，碩士，從事動物病毒研究。

寧宜寶。E-mail：ningyibao＠ivdc.org.cn

Development of an Alternative Potency Test Method for Classical Swine Fever Live Vaccine

Abstract：The potency detection method of C-strain vaccine based on classical swine fever virus rabbit infection dose（RID）is widely used in China，however，this method is greatly influenced by bread，individual difference and housing environment.In order to establish an alternative potency test strategy avoid using experimental animals，the permissive cell was inoculated with serial diluted vaccine，and then the antigen-capture ELISA，RT-nestPCR and traditional RT-PCR were utilized to detect the progeny virus.The highest positive dilution was termed as the indicator of the vaccine’s potency.The method of cell infection dose（CID）was established.The results showed that the higher live virus particles in vaccine，the higher dose of cell infection virus.Results from the potency tests of different types of C-strain vaccines indicated that the alternative strategy could be applied to potency test of ST cell-line produced C-strain vaccine and bovine testicular cell produced C-strain vaccine.Potency tests of 12 batches of ST cell-line produced C-strain vaccines and 3 batches of bovine testicular cell produced C-strain vaccines were conducted with both the alternative strategy CID and the RID test parallel.The results showed，the positive dilution of all 12 batches of ST cell-line produced C-strain vaccine were 105CID／dose，and 2.6×104～3.0×104RID／dose.And the positive dilution of 3 batches of bovine testicular cell produced C-strain vaccine were 104CID／dose and 7.0×103～8.0×103RID／dose.The potency test results of the alternative strategy CID were at certain extent corresponding to that of RID test，and it could reflect the concentration of infectious virus particles in vaccine.The alternative strategy CID is of potentiality to replace the RID test.