痛風(fēng)消顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉建忠，郭劍華，漆 偉，郭 亮，李 卿，廖興隆，劉紅露，唐榮珠

（1.重慶市中醫(yī)骨科醫(yī)院，重慶 400010；2.重慶市中藥研究院，重慶 400065）

痛風(fēng)消顆粒由黃柏、蒼術(shù)、獨(dú)活、丹參、威靈仙等組成，經(jīng)提取制成的中藥復(fù)方制劑，具有清利濕熱、活血止痛功效，主要用于急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎。

為有效監(jiān)測(cè)制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，我們用薄層色譜法對(duì)制劑中的黃柏、丹參、獨(dú)活進(jìn)行定性鑒別。采用高效液相色譜法測(cè)定黃柏中的有效成分鹽酸小檗堿的含量，報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司），薄層成像色譜儀（瑞士卡瑪公司），AE-240S型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）， KQ-400DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司） ，鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)0713-9906），黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)121510-201105）、丹參對(duì)照藥材（批號(hào)120923-201113），獨(dú)活對(duì)照藥材（批號(hào)120940-201111），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。硅膠G預(yù)制薄層板（青島海洋化工有限公司），痛風(fēng)消顆粒樣品，缺黃柏、缺丹參、缺獨(dú)活陰性樣品（均由本院提供），試驗(yàn)用乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃柏的薄層鑒別

取本品2.5g，研細(xì)，加濃氨試液3ml使?jié)櫇瘢右宜嵋阴?0ml，超聲處理40min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇2mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材1.5g，加水45mL，煎煮30min，濾過(guò)，放冷，加入濃氨試液5mL，用乙酸乙酯提取2次，每次30mL，合并乙酸乙酯提取液，蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇2mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液5μL、對(duì)照藥材溶液4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水（6∶3∶1.5∶1.5∶0.5）為展開(kāi)劑，置氨蒸氣預(yù)飽和的展開(kāi)缸中，飽和20分鐘，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖1。

圖1 黃柏薄層色譜圖

2.2 丹參的薄層鑒別

取本品4g，研細(xì)，加水50mL使溶解，用稀鹽酸調(diào)pH值至2，用乙酸乙酯提取2次，每次50mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取丹參對(duì)照藥材2g，加水50mL，超聲處理40分鐘，濾過(guò)，濾液用稀鹽酸調(diào)pH值至2，用乙酸乙酯提取2次，每次50mL，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇1mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸（5∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置碘蒸氣中顯色30min，日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色斑點(diǎn)。見(jiàn)圖2。

1 2 3 4 5圖2 丹參薄層色譜圖

2.3 獨(dú)活的薄層鑒別

取本品3g，研細(xì)，加水40ml使溶解，用乙醚提取2次，每次40mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取獨(dú)活對(duì)照藥材1g，加乙醚30mL，浸漬過(guò)夜，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)脽o(wú)水乙醇1mL使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取供試品溶液、對(duì)照藥材溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-石油醚（60～90℃）-乙酸乙酯（2∶1∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。見(jiàn)圖3。

圖3 獨(dú)活薄層色譜圖

2.4 含量測(cè)定

色譜條件：色譜柱為迪馬 C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相以乙腈-0.03moL/L磷酸二氫鈉-磷酸（30∶70∶0.08）為流動(dòng)相，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)265 nm，柱溫30℃。理論板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

圖4 高效液相色譜圖

供試品溶液的制備：取本品1.0g，研細(xì)，精密稱(chēng)定，置100mL具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100）溶液50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理40min，放冷，再稱(chēng)定重量，用鹽酸-甲醇（1∶100）溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

對(duì)照品溶液的制備：精密稱(chēng)取在100℃干燥5小時(shí)的鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，加甲醇制成每1m含16.48μg的溶液，即得。

缺黃柏陰性對(duì)照溶液的制備：取不含黃柏的陰性樣品適量，照供試品溶液制備方法，得缺黃柏陰性對(duì)照溶液。

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液各10 μL，測(cè)定。供試品色譜在與對(duì)照品色譜相應(yīng)保留時(shí)間，有相應(yīng)色譜峰，陰性對(duì)照色譜無(wú)相應(yīng)色譜峰，結(jié)果表明陰性對(duì)照不干擾樣品測(cè)定，目標(biāo)峰與相鄰色譜峰分離度均大于1.5。見(jiàn)圖4。

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液2、4、8、12、16、20 μL，注入液相色譜儀。以峰面積積分值（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程A=3476772.66C-6595.81， r=0.999 9。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿進(jìn)樣量在0.03296～0.3296 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次（進(jìn)樣量10μL），測(cè)定峰面積，鹽酸小檗堿峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.68%。表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品1份，精密稱(chēng)定，照擬定的供試品制備方法制備樣品，分別于0、1、4、8、12h注入高效液相色譜儀，測(cè)定鹽酸小檗堿峰面積，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.57%，表明供試品溶液至少在12h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，按擬定的含量測(cè)定方法，分別制備5份供試品溶液，測(cè)定鹽酸小檗堿含量，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.21%，表明本方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收率試驗(yàn)：取本品內(nèi)容物適量，研細(xì)，精密稱(chēng)定5份，分別加入鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液適量（配成溶液加入），按擬定的含量測(cè)定方法。測(cè)定鹽酸小檗堿含量，計(jì)算回收率。鹽酸小檗堿平均回收率為101.77%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.04%。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

樣品含量測(cè)定：取痛風(fēng)消顆粒不同批號(hào)樣品，按供試品制備方法處理后測(cè)定。計(jì)算每粒膠囊中鹽酸小檗堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

制劑中黃柏、獨(dú)活、丹參的薄層鑒別研究，分別以對(duì)照藥材為對(duì)照，經(jīng)方法學(xué)考察，薄層斑點(diǎn)分離良好，斑點(diǎn)圓整清晰，陰性無(wú)干擾，同時(shí)試驗(yàn)三批成品，結(jié)果均能檢出相應(yīng)色譜斑點(diǎn)，表明選定的方法具有專(zhuān)屬性和重現(xiàn)性，可作為痛風(fēng)消顆粒制劑質(zhì)量控制定性檢測(cè)指標(biāo)。

采用HPLC方法測(cè)定制劑中君藥黃柏有效成分鹽酸小檗堿的含量。供試品溶液直接采用甲醇-鹽酸（100∶1）超聲提取，直接超聲處理，操作簡(jiǎn)單，過(guò)程容易控制，用此方法制備供試品簡(jiǎn)單、快速，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，供試品溶液中目標(biāo)峰與相鄰色譜峰分離度大于1.5，該方法可用作本制劑質(zhì)量控制的含量測(cè)定。

建立鑒別黃柏、獨(dú)活、丹參的TLC法，能夠鑒別出黃柏、獨(dú)活、丹參的特征性斑點(diǎn)；建立測(cè)定鹽酸小檗堿含量測(cè)定方法，精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性符合要求。兩種方法為制定痛風(fēng)消顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了理論依據(jù)。

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄34.

[2] 盛國(guó)榮.退白湯中當(dāng)歸、黃芪、丹參、首烏、補(bǔ)骨脂的TLC法鑒別[J].海峽藥學(xué)，2012，24（1）：62.

[3] 劉新國(guó)，周莉玲，郭麗蓉.跌打止痛巴布劑中蛇床子、獨(dú)活、川芎等藥味的鑒別研究[J].中成藥，2010，32（12）：2186.

[4] 李紅玲，莫炫永.HPLC法同時(shí)測(cè)定川黃柏中鹽酸黃柏堿和鹽酸小檗堿的含量[J].中國(guó)藥房，2014，25（27），2562.

[5] 繆珊，栗艷，李捷.HPLC法測(cè)定參蛇軟膏中鹽酸小檗堿的含量[J].中國(guó)藥師，2014，17（9）：1576.