解旋酶RECQ1和細胞核相關抗原 Ki-67在腦膠質瘤組織中的表達及相關性

郭成永 梁朝輝 魏可欣 孫國柱 焦保華 趙宗茂

(保定市第一醫院神經外科，河北 保定 071000)

解旋酶RECQ1和細胞核相關抗原 Ki-67在腦膠質瘤組織中的表達及相關性

郭成永 梁朝輝 魏可欣1孫國柱 焦保華 趙宗茂

(保定市第一醫院神經外科，河北 保定 071000)

目的 分析解旋酶RECQ1和細胞核相關抗原 Ki-67在腦膠質瘤組織中的表達及其相關性。方法 選取該院神經外科收治的腦膠質瘤手術治療患者80例，根據病理學分級分為Ⅰ～Ⅱ級44例，Ⅲ～Ⅳ級36例，另外選取正常腦組織20例，利用免疫組化法檢測RECQ1、Ki-67的表達情況，計算RECQ1、Ki-67表達的相關性。結果 ①RECQ1、Ki-67在正常腦組織中表達呈陰性，在膠質瘤組織表達呈陽性；RECQ1、Ki-67在Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤組織中多為低表達，在Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織中多為高表達；②RECQ1在正常腦組織中無表達，Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤組織RECQ1表達率與Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織比較明顯降低(P<0.05)；③Ki-67在正常腦組織組織中無表達，Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤組織RECQ1表達率為75%，與Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織比較明顯降低(P<0.05)；④膠質瘤組織中RECQ1和Ki-67表達均為陽性的有57例(71.3%)，均為陰性的有14例(17.5%)。RECQ1陽性但Ki-67陰性的有4例(5%)，RECQ1陰性但Ki-67陽性的有5例(6.2%)，RECQ1和Ki-67表達呈正相關(r= 0.768，P<0.01)。結論 RECQ1和Ki-67的表達隨著腦膠質瘤組織惡性程度的增高而升高，且兩者正相關。

腦膠質瘤；解旋酶RECQ1；Ki-67；相關性

腦膠質瘤多發于中青年人群，我國腦膠質瘤患者的發病率為每年3～6人/10萬人，并且以每年1.2%的增長率逐年上升，死亡人數每年可達3萬人〔1〕。現代醫學多采取手術、放療、化療等療法〔2〕，但由于本病生長部位特殊，很難根除，而且極易復發，預后并不理想。研究發現，解旋酶RECQ1存在于多種腫瘤中，而缺乏RECQ1基因的腫瘤細胞增殖、分化受到抑制〔3〕。有報道稱，向小鼠腫瘤部位注射對RECQ1起沉默作用的RNA，可以明顯抑制小鼠腫瘤的生長，RECQ1可以作為治療腦膠質瘤的新靶點進行研究〔4〕。筆者通過觀察腦膠質瘤和正常腦組織中RECQ1、Ki-67表達情況以及兩者的相關性等指標，探索腦膠質瘤治療的新靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2012年1月至2014年1月于我院以腦膠質瘤為診斷而收入院進行手術治療的患者80例，男42例，女38例，平均年齡(45.3±5.3)歲，患者均未采用放療、化療等手段治療，無其他惡性腫瘤性疾病。術中取得的膠質瘤組織，依照世界衛生組織2010年的神經系統腫瘤病理學分級標準分級〔5〕，其中Ⅰ～Ⅱ級44例，Ⅲ～Ⅳ級36例；正常腦組織20例，取自腦外傷進行減壓術的患者，男13例，女7例，平均年齡(42.7±6.1)歲。兩組患者的一般資料差異無統計學意義(P>0.05)。患者及家屬自愿參與本實驗，并簽署知情同意書。方案獲得我院倫理委員會批準并全過程跟蹤。

1.2 主要試劑和儀器 兔抗人RECQ1多克隆抗體(GeneTex)；兔抗人Ki-67單克隆抗體(上海領成)；二抗免疫組織化學試劑盒、DAB顯色試劑盒(北京中杉)；PBS、多聚甲醛溶液(自配)；自動包埋機(湖北慧達)；切片機(無錫華寶)；細胞培養箱、恒溫水浴箱(上海佳航)；光學顯微鏡(德國Leica)。

1.3 方法

1.3.1 標本制備 每例分別取1 cm×1 cm×0.5 cm大小的膠質瘤組織和正常腦組織，置于40 g/L多聚甲醛溶液中2 h進行固定，之后采用95%乙醇脫水，經2 h浸蠟，用自動包埋機制成蠟塊，切片機制成厚度為4 μm的切片〔6〕。

1.3.2 免疫組化染色法 按照抗體說明書進行操作，將制備好的切片置入恒溫干燥箱中1 h，設置溫度為60℃；分別利用二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟15 min；利用不同梯度乙醇(無水、95%、80%乙醇)逐級脫水：蒸餾水水化；利用3%過氧化氫液滅活內源性過氧化物酶，在室溫下孵育30 min左右；用PBS液浸泡2次，5 min/次；切片浸入200 ml抗原修復液中修復，高壓加熱3 min，冷卻至室溫；擦凈組織表面液體，加入血清工作液，置入溫箱中1 h，溫度為37°，中和非特異性反應；擦凈玻片，分別加入兔抗人RECQ1抗體、ki-67抗體(RECQ1濃度稀釋至1∶750，Ki-67濃度稀釋至1∶100)，置于4℃過夜；復溫后用PBS液浸泡2次，5 min/次；滴加生物素化二抗工作液，37℃孵育30 min；利用DAB染色；蘇木輕度復染3 min；之后利用不同濃度酒精(80%、95%、無水乙醇)脫水；封片采用中性樹膠。

1.3.3 鏡下觀察 由兩名病理醫師分別在高倍鏡(×400)下觀察各標本，根據染色強度以及陽性細胞數評定RECQ1和 Ki-67的表達情況，兩位醫師的觀察結果對比后作為最終結果。陽性細胞著色為淡黃色至棕褐色顆粒，顏色越深、范圍越大，陽性率越強。根據染色程度評定標準〔7〕，1分：無染色或淡黃顆粒；2分：中等量棕黃顆粒；3分，棕色顆粒量大色深。根據陽性細胞計數，1分：陽性細胞少于5%；2分：存在5%～30%陽性細胞；3分：存在30%～65%陽性細胞；4分：存在65%以上的陽性細胞。染色程度得分×陽性細胞計數得分≤1分為陰性，2～6分屬于低表達(+)，>7分者屬高表達()。

1.4 統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗和秩和檢驗。

2 結 果

2.1 免疫組化結果 染色呈淡黃色至棕褐色顆粒，為陽性；RECQ1、Ki-67在正常腦組織中表達呈陰性，在膠質瘤組織表達呈陽性；RECQ1、Ki-67在Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤組織中多為低表達，在Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織中多為高表達，見圖1。

2.2 膠質瘤組織、正常腦組織中RECQ1、Ki-67的表達率比較 RECQ1、Ki-67在正常腦組織組織中無表達，Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤組織表達率與Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織比較明顯降低(P<0.05)，見表1。

正常腦組織RECQ1

正常腦組織Ki-67

Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤RECQ1

Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤Ki-67

Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤RECQ1

Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤Ki-67

表1 膠質瘤組織、正常腦組織中RECQ1、Ki-67的表達比較〔n(%)〕

組別nRECQ1陰性低表達高表達表達率Ki?67陰性低表達高表達表達率Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤363(8 3)6(16 7)27(75 00)33(91 7)5(13 9)7(19 4)24(66 7)31(86 1)Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤4413(29 5)26(59 1)5(11 4)31(70 5)1)11(25 0)25(56 8)8(18 2)33(75 0)1)正常腦組織2020(100 0)0(0)0(0)020(100 0)0(0)0(0)0

與Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤組織比較：1)P<0.05

2.3 膠質瘤組織中RECQ1和Ki-67表達的相關性 膠質瘤組織中RECQ1和Ki-67表達均為陽性的有57例(71.3%)，均為陰性的有14例(17.5%)。RECQ1陽性但Ki-67陰性的有4例(5%)，RECQ1陰性但Ki-67陽性的有5例(6.2%)，RECQ1和Ki-67表達呈正相關(r=0.768，P<0.01)。

3 討 論

腦膠質瘤來源于神經上皮細胞，其發生可能與遺傳因素、電離輻射、亞硝基化合物、病毒感染、空氣污染等導致的基因突變有關〔8〕，隨著社會的發展，環境污染的加重及人們生活方式的轉變，腦膠質瘤發病率不斷上升。腦膠質瘤多呈浸潤性生長，手術難度大，且對放療、化療等治療方式敏感性差，極易復發，這些特點使得其具有較高的死亡率，引起醫學界的關注，近年來基因工程飛速發展，尋找新的治療靶點成為目前常見的研究方向。解旋酶RECQ1屬于解旋酶家族的一種，具有催化DNA、RNA鏈解旋的作用，能夠促進DNA的復制、修復、轉錄，在多種腫瘤組織中為高表達，對腫瘤組織的增殖分化起到重要作用。資料顯示，若RECQ1存在缺陷，腫瘤細胞的基因穩定性受到影響，增殖減慢〔9〕。Ki-67是一種核抗原，其在腫瘤細胞中等的作用已被證實，它與細胞周期有關，在腫瘤細胞中具有高表達率，是反映惡性細胞增殖活躍程度的指標〔10〕。

本研究結果提示RECQ1、Ki-67在膠質瘤組織表達率越高，腫瘤組織惡性程度越高，細胞增殖越快；相關性分析結果顯示Ki-67的表達隨RECQ1表達增高而升高，受其調控。

1 許志強，徐倫山，蔣曉江，等.腦膠質瘤的臨床治療進展〔J〕.中國臨床神經科學，2010;8(4):431-5.

2 徐國政，袁先厚.腦膠質瘤靶向治療新進展〔J〕.中國臨床神經外科雜志，2011;16(9):568-72.

3 熊曉鵬，胡超蘇.腦膠質瘤的放射治療臨床研究進展〔J〕.中國神經腫瘤雜志，2006;4(3):173-9.

4 吳小璐，楊初蔚，張建生，等.腦膠質瘤危險因素的病例-對照研究〔J〕.中國臨床神經外科雜志，2008;13(7):400-1，405.

5 翟曉東.RECQ1解旋酶在人腦膠質瘤中的表達及意義〔D〕.石家莊：河北醫科大學，2013.

6 蘇鈺清，李蘭梅，高建洲，等.cyclinA和Ki-67在腦膠質瘤中的表達〔J〕.現代中西醫結合雜志，2013;22(3):229-30，238.

7 蘇鈺清，李蘭梅，王獻明，等.cyclinA及相關因子p27～(kip1)、Ki-67在膠質瘤中的表達及相關分析〔J〕.現代中西醫結合雜志，2013;24:2626-8.

8 朱 航，雷 迅，張 帆，等.腦膠質瘤危險因素Meta分析及危險因素控制后發病率的變化趨勢〔J〕.中國醫科大學學報，2012;6:554-8.

9 任 華.RecQ解旋酶分子特性的研究〔D〕.華東師范大學，2010.

10 王獻明，蘇鈺清，李蘭梅.p27～(kip1)和Ki-67在人腦膠質瘤中的表達及意義〔J〕.現代中西醫結合雜志，2012；21(25):2739-40.

〔2014-11-16修回〕

(編輯 李相軍)

河北省衛生廳科研基金項目(20130511)

焦保華(1954-)，男，主任醫師，主要從事膠質瘤研究。

郭成永(1974-)，男，碩士，主治醫師，主要從事膠質瘤研究。

R739.41

A

1005-9202(2015)12-3259-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.032

1 河北醫科大學第二醫院神經外科