鬼針草總黃酮對心肌缺血再灌注大鼠的保護作用

馬瑜紅 李 玲 王 斌 夏西超

(南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473003)

鬼針草總黃酮對心肌缺血再灌注大鼠的保護作用

馬瑜紅 李 玲 王 斌 夏西超

(南陽醫學高等專科學校，河南 南陽 473003)

目的 研究鬼針草總黃酮(TFB)對缺血再灌注大鼠心肌的保護作用，并探討其作用機制。方法 將雄性Wistar大鼠50只隨機分為5組：假手術組(SH組)、心肌缺血再灌注模型組(I/R組)、TFB低、中、高劑量組(TFBL組、TFBM組、TFBH組)，每組10只。TFB各組分別給予鬼針草總黃酮灌胃，劑量分別為40、80、160 mg/kg，1次/d，連續給藥14 d；除SH組外，其他各組結扎冠狀動脈左前降支，使心肌缺血30 min，再灌注120 min。ELISA法測定血清乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-8含量，測定心肌組織丙二醛(MDA)含量和過氧化物酶(SOD)活力，氯化三苯基四氮唑紅(TTC)染色法測定心肌梗死面積，透射電鏡觀察心肌超微結構。結果 與I/R組相比，TFB各組均能降低心肌組織MDA含量并提高SOD活力，減小心肌梗死面積，改善心肌超微結構；TFBM、TFBH組能有效降低血清中LDH、CK、TNF-α和IL-8的釋放量。結論 TFB預處理可減輕缺血再灌注心肌損傷，可能與其抗炎和抗自由基作用有關。

鬼針草總黃酮；缺血再灌注；抗氧化；抗炎；超微結構

急性心肌梗死后采用溶栓治療、經皮冠狀動脈介入術(PCI)或冠狀動脈旁路移植術(CABG)等手段對缺血心肌實施再灌注是主要治療手段，而缺血后再灌注，會使心肌細胞功能進一步降低，導致細胞凋亡甚至死亡，造成心肌缺血再灌注損傷(MIRI)。防治MIRI以提高急性心肌缺血再灌注療法的臨床療效，成為目前研究的熱點。中藥及其有效成分在防治MIRI方面發揮著越來越重要的作用〔1〕。鬼針草系菊科植物，全國大部分地區均有分布。其苦，平，無毒，有清熱解毒、祛風、活血之功效〔2〕。鬼針草能有效治療高血壓、高脂血癥、糖尿病，并能抑制血小板聚集、抗血栓生成，并具有良好的抗氧化作用〔2～7〕。鬼針草總黃酮(TFB)是鬼針草中的主要有效成分之一，在抗肝纖維化中的作用多有報道〔8〕。但國內外未見其對缺血再灌注心肌的保護作用及其機制的報道。本實驗研究TFB對缺血再灌注大鼠心肌的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 鬼針草采自南陽市王村野外，經我校藥用植物學袁國卿副教授鑒定，為三葉鬼針草，全草入藥。鬼針草總黃酮由南陽醫學高等專科學校中藥分析實驗室提供。

1.2 試劑 丙二醛(MDA)、過氧化物酶(SOD)測試試劑盒均購自南京建成生物公司；大鼠乳酸脫氫酶(LDH)、大鼠肌酸激酶(CK)定量檢測試劑盒(ELISA)均購自美國Rapidbiol公司；腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-8試劑盒(ELISA)均購自美國Genzyme公司。

1.3 儀器 7020全自動生化分析儀(HITACHI公司，日本)； DMR+Q550型病理圖像分析系統(Leica公司，德國)；TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用有限公司，北京)；精密電子天平(CP323P，德國)；多功能酶標儀(Becton Dick-inson公司，美國)；DH-1型小動物呼吸機(浙江醫科大學醫學儀器廠，中國)。

1.4 動物處理 健康雄性Wistar大鼠50只，體質量190～230 g，SPF級，購自山東魯抗醫藥股份有限公司質檢中心實驗動物室，合格證號scxk魯2008-0002。在恒溫(19～25℃)、相對濕度40%～60%環境中，以普通飼料分籠適應性飼養1 w。隨機分成假手術組(SH組)、心肌缺血再灌注組(I/R組)、TFB低、中、高劑量組(TFBL、TFBM和TFBH組)5組各10只。SH組、I/R組每日灌胃給予等容量生理鹽水，給藥組分別每日灌胃給予TFB 40、80、160 mg/kg體質量。每周稱重1次，調整給藥劑量。連續給藥14 d。第15天，用10%水合氯醛麻醉(3 ml/kg體重)大鼠后仰位固定于解剖臺，分離氣管并插管，連接小動物呼吸機(DH-1型)輔助呼吸(調整通氣量為1 L/min，EXP/INSP為1∶2，呼吸頻率70～80 次/min，潮氣量為 8～12 ml)。于胸骨左側第四肋間打開胸腔暴露心臟，結扎冠狀動脈前降支30 min，以心肌顏色變暗為心肌缺血標志。松開結扎線行心肌再灌注120 min。假手術組僅在冠狀動脈前降支穿線，但不結扎。

1.5 透射電鏡觀察心肌超微結構 每組選2只大鼠取缺血區心肌組織，經2.5%戊二醛溶液中固定、冷藏后送紹興文理學院，用透射電鏡觀察心肌超微結構。

1.6 血清LDH、CK、TNF-α和IL-8活性測定 實驗結束時于大鼠右頸內靜脈采血2 ml，靜置15 min，以3 000 r/min高速冷凍離心5 min，取上清液保存于-20℃中，ELISA法檢測CK、LDH、TNF-α、IL-8活性。

1.7 心肌組織中MDA含量、SOD活性測定 取缺血區心肌組織，冰生理鹽水反復沖洗，用磷酸鹽緩沖液配置成10%的心肌組織勻漿，離心后取上清液，按試劑盒要求測定MDA含量和SOD活性。

1.8 心肌梗死面積的測定 取結扎線下缺血區心室肌凍存5 min后取出，從心尖至心底橫切制心室肌組織切片，厚度約為2 mm，在37℃下用氯化三苯基四氮唑紅(TTC，1%)的磷酸緩沖液溫孵10 min。梗死心肌不染色呈白色，未梗死心肌染色后呈紅色，描計輪廓并掃描輸入病理圖像分析系統，用左心室組織切片梗死區面積除以左心室組織切片總面積計算梗死面積百分率。

1.9 統計學方法 采用SPSS13.0統計進行F檢驗，q檢驗，秩和檢驗。

2 結 果

2.1 透射電鏡下各組心肌超微結構改變 SH組心肌細胞核完整，線粒體形態和數量正常，嵴排列整齊；I/R組少見細胞核，核膜缺損，線粒體內無嵴結構；I/R+TFBL組心肌細胞核仁內陷，線粒體數量增多，內有少量空泡，嵴尚可見；I/R+TFBM組心肌細胞內線粒體數量正常，核膜微內陷，毛細血管細胞完好；I/R+TFBH組心肌細胞內核完好，胞膜清晰，線粒體稍多，嵴清晰可見。見圖1。

圖1 各組心肌細胞超微結構(透射電鏡，×20 000)

2.2 TFB預處理對血清LDH、CK、TNF-α 和IL-8的影響 與SH組比較，I/R組心肌缺血再灌注后血清中的LDH、CK、TNF-α和IL-8水平升高明顯(P<0.05)；與I/R組比較，TFB M和TFBH組血清中的LDH、CK、TNF-α和IL-8水平降低，且存在一定的量效關系(P<0.05)。見表1。

2.3 TFB預處理對心肌組織MDA含量、SOD活性的影響 與SH組比較，I/R組心肌組織中MDA含量水平明顯升高、SOD活性顯著增高(P<0.05)； 與 I/R組比較，TFB各劑量組均可降低MDA含量，提高SOD活性，且有一定的量效關系(P<0.05)。見表1。

2.4 各組心肌梗死面積 與I/R組相比，TFB各組均有效降低心肌梗死面積，劑量愈大效果愈明顯(P<0.05)。見表1。

表1 TFB對血清LDH、CK、TNF-α、IL-8、心肌組織MDA、SOD、心肌梗死面積的影響

與SH組相比：1)P<0.05；與I/R組相比：2)P<0.05

3 討 論

心肌酶CK和LDH水平是反映心肌損傷的重要標志，心肌缺血再灌注后CK和LDH含量明顯升高。本文結果顯示TFB可有效降低血漿CK和LDH含量，對缺血再灌注心肌有良好的保護作用。心肌缺血再灌注損傷的發生機制復雜，研究表明與自由基、炎癥、鈣超載、心肌纖維能量代謝障礙、細胞凋亡等密切相關〔9，10〕。

TNF-α是機體處于應激、炎癥、感染、組織損傷和休克時產生的促炎癥性細胞因子，與心肌梗死、充血性心力衰竭、動脈粥樣硬化等多種心臟疾病密切相關。TNF-α可抑制心肌收縮力、左室射血分數，降低全身血管阻力，降低血壓，擴張心室，還可誘導白三烯、血小板活性因子和血栓素A2等釋放，通過促進中性粒細胞與缺血再灌注部位心肌細胞黏附而損傷心肌〔11〕。IL-8主要由單核-巨噬細胞、血管內皮細胞等產生〔12〕，在通過誘導中性粒細胞黏附于內皮細胞及內皮下基質造成心肌損傷中發揮重要作用〔13〕。TNF-α還可誘導IL-8等其他體液炎性介質的生成，這些細胞因子相互作用，形成炎性反應鏈，進一步加重機體損傷〔14〕。本實驗結果顯示TFB可降低缺血再灌注大鼠血清TNF-α、IL-8含量，具有抗炎作用，并具有劑量依賴性。

氧化應激是心肌缺血再灌注損傷發生發展的啟動因素之一〔15〕。在缺血、缺氧條件下，氧自由基既可促使心肌細胞壞死，又可通過多種途徑介導心肌細胞的凋亡。缺血再灌注時大量自由基引起脂質過氧過， MDA水平升高損傷心肌，MDA是反映心肌細胞損傷嚴重程度的重要指標。SOD是體內的主要抗氧化酶，是反映機體抗氧化能力的特異性指標，可清除氧自由基，保護細胞。本研究結果顯示TFB可提高缺血再灌注大鼠心肌組織SOD活性，降低MDA含量。綜上，TFB有較好防治心肌缺血再灌注損傷、保護心肌作用，可能與其抗炎和抗脂質過氧化作用有關。

1 潘贊紅,金 鑫.中醫藥對心肌缺血再灌注損傷保護作用研究概況〔J〕.天津藥學,2008;20(4):64-6.

2 孟祥穎,李向高,羅維穎,等.鬼針草的研究概況〔J〕.中藥材,2001;24(6):452-4.

3 趙 燕,趙 瑩,王緒成,等.鬼針草的化學成分和藥理作用研究進展〔J〕.中國藥房,2007;18(15):1189-90.

4 錢岳晟,張偉忠,周懷發,等.鬼針草對血壓影響的臨床研究〔J〕.浙江中醫學院學報，2003;27(1)：23-5.

5 李 玲,劉旭杰,郝 洪.鬼針草降壓作用與腎上腺素受體的關系〔J〕.第四軍醫大學學報,2004;25(23):51.

6 李 帥,匡海學,畢明剛,等.鬼針草提取物對Ⅱ型糖尿病小鼠降血糖作用的研究〔J〕.中醫藥學報,2003;31(5):37-9.

7 黃川鋒,馬瑜紅,周 新,等.鬼針草提取物對實驗性高脂血癥大鼠血脂和NO及NOS的影響 〔J〕.中國現代藥物應用,2009;3(17):14-6.

8 程新燕.鬼針草總黃酮對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1/smad通路的影響〔J〕.中國實驗方劑學,2013;19(21):253-7.

9 楊葉猗,楊作成.心肌缺血再灌注損傷保護劑研究進展〔J〕.實用預防醫學,2008;15(2)：606-8.

10 Magaki S，Mueller C，Dickson C，etal.Increased production of inflammatory cytokines in mild cognitive impairment〔J〕.Exp Gerontol，2007;42(3)：233-40.

11 Meldrum DR.Tumor necrosis factor in the heart〔J〕.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，1998;274(11):R577-95.

12 White MY，Tehen AS，Mc Carron HC，etal.Proteomics of ischemia and reperfusion iniunes in rabbit myocardium with and without intervention by an Oxygen-free radical scavenger〔J〕.Proteomies，2006;6(23)：6221-33.

13 尚 曉,陸 紅.阿托伐他汀對大鼠心肌缺血再灌注的影響及作用機制〔J〕.陜西醫學雜志,2010;39(11):1458-60.

14 Wang M,Tsai BM,Kher A,etal.Role of endogenous testosterone in myocardial proinflammatory and proapoptotic signaling after acute ischemia-reperfusion〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005;288(1):H221-6.

15 Di Filippo C,Cuzzocrea S,Rossi F,etal.Oxidative stress as the leading cause of acute myocardial infarction in diabetics〔J〕.Cardiovasc Drug Rev,2006;24(2):77-87.

〔2013-12-17修回〕

(編輯 苑云杰)

河南省教育廳自然科學研究項目(No.2011C310007)

馬瑜紅(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事中藥藥理和毒理學研究。

R285.5

A

1005-9202(2015)12-3240-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.023