自噬相關基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎縮側索硬化癥轉基因鼠海馬中的表達及意義

周風華 劉煥彩 陳燕春 鞠 杰 蒲雷東 王巧真 接琳琳 丁昊宇

(濰坊醫學院病理學教研室，山東 濰坊 261053)

自噬相關基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎縮側索硬化癥轉基因鼠海馬中的表達及意義

周風華 劉煥彩1陳燕春2鞠 杰2蒲雷東2王巧真2接琳琳2丁昊宇2

(濰坊醫學院病理學教研室，山東 濰坊 261053)

目的 觀察自噬相關基因Atg4B及LC3-Ⅱ在肌萎縮側索硬化癥(ALS)轉基因鼠海馬組織中的表達變化，探討細胞自噬機制在ALS發病中的作用及意義。方法 選擇SOD1-G93A轉基因鼠進行試驗，分別于發病早、中、晚期，通過RT-PCR、免疫熒光檢測小鼠海馬組織中Atg4B、LC3-Ⅱ在mRNA、蛋白水平的表達及變化。結果 與野生型鼠相比較，轉基因鼠的Atg4B在mRNA及蛋白水平表達均下調；LC3-Ⅱ在蛋白水平表達上調，在mRNA水平變化不明顯。結論 自噬相關基因Atg4B及LC3-Ⅱ參與了ALS發病，ALS海馬組織的病變與自噬異常有關。

自噬；ALS；Atg4B；LC3-Ⅱ

肌萎縮側索硬化癥(ALS)是一種選擇性上、下運動神經元進行性變性為主要特征的神經退行性疾病，臨床主要表現為進行性全身肌肉無力，多數患者在發病3～5年內死于呼吸衰竭〔1〕。除運動系統功能障礙外，部分ALS患者可出現明顯的認知功能等行為學損害〔2〕因而ALS的發展可能與海馬結構有關〔3〕。細胞自噬是真核細胞特有的生命現象〔4〕，參與人體的多種生理及病理過程。Atg4B及LC3-Ⅱ是兩個重要的自噬相關基因，參與了自噬體的形成。Morimoto等〔5〕研究發現，ALS的發病與細胞自噬有關，而自噬基因Atg4B及LC3-Ⅱ在ALS海馬中的表達變化及作用尚無明確報道。本實驗通過檢測Atg4B及LC3-Ⅱ在ALS轉基因鼠海馬組織中的表達變化，探討細胞自噬在ALS發病中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型及標本處理 野生型及突變型SOD1-G93A轉基因小鼠購自美國Jackson Laboratories。該動物模型攜帶有突變的SOD1基因，能夠模擬人類ALS的疾病進展及臨床表現，是研究ALS疾病的理想動物模型。嚴格按轉基因鼠飼養條件進行飼養，成年鼠按雌雄比1∶1進行合籠，出生后的小鼠約30 d后，提取鼠尾DNA，基因擴增進行野生型及突變型小鼠鑒定。選取突變型成年鼠18只，隨機分為發病早期(生后約95 d)、發病中期(出生后約108 d)、發病晚期(出生后約122 d)。每個時間點選3只鼠進行4%多聚甲醛灌注固定，剝離大腦，30%蔗糖脫水，冰凍切片，進行免疫熒光檢測；每個時間點選3只鼠拉頸處死，剝離海馬，提取總RNA并反轉錄合成cDNA，進行RT-PCR檢測；以相同數量的同窩野生型鼠作為對照組。

1.2 主要試劑 兔抗多克隆抗體Atg4B，anbo公司；LC3-Ⅱ，Abcam公司；Cy3標記的羊抗兔IgG，美國Jackson Immuno Research Laboratoris；RT-PCR試劑盒，北京天根生化科技有限公司；OligdT，美國Promega公司；5×逆轉錄Buffer，美國Promega公司；M-MlV逆轉錄酶，美國Promega公司。

1.3 免疫熒光標記 將冰凍切片室溫晾片2 h，滴加10%山羊血清，37℃封閉40 min，分別滴加兔抗多克隆抗體Atg4B、LC3-Ⅱ(濃度均為1∶100)，4℃孵育過夜，滴加Cy3標記的羊抗兔IgG熒光二抗(濃度為1∶400)，避光37℃孵育30 min，滴加終濃度為10 μg/ml的Hoechst33258，避光37℃孵育15 min，防淬滅熒光封片劑封片，用熒光顯微鏡觀察Atg4B及LC3-Ⅱ表達情況。實驗過程中的沖洗緩沖液均為0.01 mol/L的PBS緩沖液。

1.4 RT-PCR (1)總RNA的提取:取大腦海馬組織，加入500 μl TRIzol，冰上充分勻漿，具體步驟參照文獻〔6〕。(2)逆轉錄反應。(3)PCR擴增反應：Atg4B上游引物：5′TACAGCATTTTCACAGAGAAGGACG 3′，Atg4B下游引物：5′CTCCAGCAGGGAACCCATTAC3′。LC3-Ⅱ上游引物：5′CCCAGTGATTATAGAGCGATACAAG3′，LC3-Ⅱ下游引物：5′TGTCTCCTGCGAGGCATAAAC3′。以1 μl逆轉錄產物為模板，2×Taq PCR Mastermix 10 μl。Atg4B、LC3-Ⅱ上下游引物分別各0.5 μl，β-actin上游引物、下游引物各0.3 μl，分別組成PCR反應體系。PCR儀中運行以下程序：94℃預變性3 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環30次，72℃延伸5 min后冷卻至4℃。

1.5 統計學處理 應用IPP5.1圖像分析軟件進行統計學分析。測量Atg4B及LC3-Ⅱ免疫熒光圖片陽性細胞累積光密度(IOD)值。測量RT-PCR顯示的mRNA擴增帶與β-actin擴增帶的IOD值。用SPSS20.0軟件行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1 Atg4B在海馬組織中的表達 免疫熒光檢測顯示，在野生型及突變型小鼠海馬組織中，均檢測到Atg4B陽性細胞，陽性細胞主要分布在海馬的DG區，CA可見少量陽性細胞。與野生型小鼠比較，在發病的早期，突變型小鼠Atg4B陽性細胞累積光密度變化不明顯，而在發病中、晚期，突變型小鼠Atg4B陽性細胞累積光密度在DG區明顯降低(68.5±5.2 vs 32.3±2.6,P<0.05)，CA區陽性細胞累積光密度變化不明顯(P>0.05)。RT-PCR結果顯示，與野生型小鼠比較，在發病的早(61.2±5.7 vs 58.2±7.2)、中(60.1±5.2 vs 38.5±4.7)、晚期(59.5±4.2 vs 39.7±3.5)，突變型小鼠Atg4B mRNA水平明顯下調(P<0.05)，見圖1，圖2。

圖1 Atg4B在突變型小鼠122 d海馬組織中的表達(標尺=50 μm)

圖2 Atg4B在突變型小鼠發病早、中、晚期mRNA表達變化

圖3 LC3-Ⅱ在突變型小鼠122 d海馬組織中的表達(標尺=50 μm)

圖4 LC3-Ⅱ在突變型小鼠發病早、中、晚期mRNA表達變化

2.2 LC3-Ⅱ在海馬組織中的表達呈上調趨勢 免疫熒光檢測顯示，在野生型及突變型小鼠海馬組織中，均檢測到LC3-Ⅱ陽性細胞，陽性細胞主要分布在海馬的DG區。與野生型小鼠比較，在發病的早期，突變型鼠LC3-Ⅱ陽性細胞累積光密度變化不明顯，在發病的中、晚期，突變型鼠LC3-Ⅱ陽性細胞累積光密度明顯增加(62.5±6.1 vs 35.3±4.5,P<0.05)。RT-PCR結果顯示，與野生型小鼠比較，在發病的早(36.5±4.2 vvs 34.1±5.3)、中(38.3±5.1 vs 39.1±4.3)、晚期(40.5±5.6 vs 39.8±4.2)，突變型小鼠LC3-Ⅱ mRNA水平變化不明顯(P>0.05)，見圖3，圖4。

3 討 論

自噬是真核細胞特有的生命現象〔4〕，參與人體的多種生理及病理過程。有研究報道，自噬與阿爾茨海默病(AD)、亨廷頓舞蹈病(HD)和帕金森病(PD)等多種神經退行性疾病有關〔6〕。在這些神經退行性疾病中，自噬可能通過清除異常折疊的蛋白而延緩疾病的進展。尸體剖驗及動物實驗均證實在ALS脊髓組織中自噬小體的數量增加〔5〕，提示在ALS發病中自噬被激活，但目前自噬的激活機制及意義尚未完全闡明。

微管相關蛋白輕鏈3(LC3)是哺乳動物細胞中酵母8(Atg8)基因的同源物，參與細胞的自噬過程。LC3有Ⅰ型和Ⅱ型之分，當自噬尚未發生時，LC3以可溶性的LC3-Ⅰ存在，當自噬發生時，LC3與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(PE)結合，轉化成脂溶性的LC3-Ⅱ〔7〕。LC3-Ⅱ的含量多少與自噬泡的數量成正比，因此LC3-Ⅱ的表達強度與自噬活性密切相關，是自噬檢測的標記〔8〕。LC3-Ⅱ與多種神經退行性疾病有關，在AD轉基因鼠及β-淀粉樣蛋白作用的原代皮質神經元中LC3-Ⅱ表達上調。而亨廷頓蛋白的突變導致了骨骼肌中LC3-Ⅱ的合成增加〔9〕。Morimoto等〔5〕研究發現，在ALS發病期，LC3-Ⅱ在SOD1G93A轉基因小鼠模型脊髓中是上調的，表明LC3-Ⅱ誘導的自噬激活可能參與了ALS發病。我們的實驗結果顯示，在ALS發病期，海馬組織中LC3-Ⅱ在mRNA及蛋白水平均明顯上調，由此提示，ALS海馬組織的病變與自噬異常有關。最近，一個大規模的蛋白質組學實驗揭示在人自噬過程中，LC3-Ⅱ和它的直系同源物組成了約67種蛋白的網絡〔10〕。而LC3-Ⅱ調控自噬途徑的機制可能與蛋白質之間的相互作用有關。Atg4是一種半胱氨酸蛋白激酶，能夠可逆性的催化LC3形成脂質化及去脂質化LC3。在哺乳動物中，有四種Atg4的同系物，包括Atg4A、Atg4B、Atg4C及 autophagin-4，其中Atg4B對LC3-Ⅱ有明顯的特異性及高效性。研究發現，非活化Atg4B的高表達可以通過抑制LC3-I的脂質化而明顯抑制自噬體的形成〔11〕，由此提示，Atg4B和LC3通過之間的相互作用參與了細胞的自噬過程。目前，在ALS發病中Atg4B和LC3-Ⅱ是否參與了海馬組織病變尚未見報道。我們的研究結果顯示，Atg4B和LC3-Ⅱ均主要在海馬組織的DG區表達，但是表達趨勢相反，在ALS發病期，海馬組織中Atg4B的表達下調，而LC3-Ⅱ的表達明顯上調，提示Atg4B和LC3-Ⅱ在ALS發病期海馬組織的病變中發揮了作用，而且兩者之間還可能通過一定的調控機制共同參與其中。同時，我們還發現，在ALS轉基因鼠的海馬組織中，自噬相關基因LC3-Ⅱ在蛋白水平明顯上調，但是在mRNA水平變化并不明顯，因此，LC3-Ⅱ在蛋白水平的表達可能存在更復雜的分子機制。這些分子機制有待于我們進一步研究和探討。

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5 Morimoto N，Nagai M，Ohta Y，etal.Increased autophagy in transgenic mice with a G93A mutant SOD1 gene〔J〕.Brain Res，2007；1167：112-7.

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〔2014-09-19修回〕

(編輯 郭 菁)

國家自然科學基金青年基金(81401066)；山東省自然科學基金(ZR2012HQ021)；山東省教育廳課題(J11LF16，J12LK51，J13LK05)；山東省醫藥衛生科技發展計劃項目(2013W-S0279)；濰坊市科學技術發展計劃項目(201302089，2013-01074)

陳燕春(1979-)，女，副教授，博士，主要從事神經發育與神經退行性疾病相關研究。

周風華(1977-)，女，副教授，碩士，主要從事神經病理研究。

R744.8

A

1005-9202(2015)12-3216-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.013

1 濰坊醫學院臨床學院 2 濰坊醫學院組織胚胎學教研室