腦出血患者血腫周圍組織T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3的表達及意義

畢 勝 劉 群 范 佳 李 冬 王李鳴 趙巖巖 關雪蓮 侯麗淳 田嘉瑩 王增冕 李曉濤 李培育

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

腦出血患者血腫周圍組織T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子-3的表達及意義

畢 勝 劉 群1范 佳2李 冬 王李鳴 趙巖巖 關雪蓮 侯麗淳 田嘉瑩 王增冕 李曉濤 李培育

(佳木斯大學附屬第一醫院，黑龍江 佳木斯 154002)

目的 觀察腦出血血腫周圍組織T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3的表達，并探討其在腦出血發病中的意義。方法 行血腫清除術的腦出血患者48例按發病距手術取材時間分為≤6 h組、6～24 h組、24～72 h組和>72 h組，每組12例。另選取遠離血腫的腦組織12例作為對照組。免疫組織化學染色法檢測TIM-3蛋白的表達，RT-PCR法檢測TIM-3 mRNA的表達。結果 與對照組相比，≤6 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達無統計學差異(P>0.05)。與對照組相比，其他各實驗組血腫周圍組織中TIM-3的表達均具有統計學差異(P<0.05)。24～72 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達顯著高于其他各實驗組(P<0.05)。RT-PCR 法檢測血腫周圍組織TIM-3的表達表現出相同的趨勢。結論 腦出血血腫周圍腦組織TIM-3 的表達在發病6 h后增高，24～72 h達最高，72 h后降低。TIM-3參與腦出血后的病理過程，可能與炎癥反應有關。

腦出血;T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3

多種機制參與腦出血后的炎癥反應及組織損傷。T細胞免疫球蛋白黏蛋白分子(TIM)-3與多種炎癥性疾病的發病有關，本文擬研究腦出血血腫周圍組織TIM-3的表達及其意義。

1 材料與方法

1.1 實驗分組 2013年1月至2014年12月我院神經外科收治的腦出血行血腫清除術患者48例。按發病距手術取血腫旁1 cm左右腦組織時間分為4個實驗4組，分別為≤6 h組、>6 h且≤24 h 組、>24 h且≤72 h 組和>72 h 組，每組12例。另選取遠離血腫的腦組織6例作為對照組。均符合診斷標準〔1〕。

1.2 主要試劑 RT-PCR 試劑盒，湖南晶科生物科技有限公司；PCR 引物，上海生工生物工程有限公司；Trizol，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司； SP 試劑盒，北京北瑞達醫藥科技有限公司；DAB 顯色劑，上海寶曼生物科技有限公司；山羊抗兔 HRP 標記的二抗，上海研卉生物科技有限公司；兔抗人TIM-3 多克隆抗體，上海領成生物科技有限公司。

1.3 取材 將每塊腦組織分兩份，一份以液氮凍存，一份以10%甲醛固定液中固定，石蠟包埋。

1.4 TIM-3蛋白和mRNA測定 免疫組織化學染色檢測TIM-3蛋白表達。光鏡學檢查，細胞形態完整，胞質中棕黃色顆粒狀物質為 TIM-3 陽性細胞。在高倍鏡(×400)下隨機選取20個視野計數陽性細胞，取其平均值為該樣本的陽性細胞數。RT-PCR法檢測TIM-3 mRNA 的表達。PCR引物設計：內參基因β-actin(299 bp)的引物序列為：上游5'-CCTGGACTTCGAGCAAGA-3'，下游5'-GGGCAGTGATCTCCTTCT- 3'，目的基因TIM-3(558 bp)的引物序列為：上游5'-CCAAATCCCAGGCATAAT-3'，下游5'-AAGCGACAACCCAAAGGT-3'。采用Trizol法提取腦組織中的總 RNA。將 RNA 溶解在10 μl DEPC處理過的水中。將RNA逆轉錄成cDNA。通過PCR將DNA片段擴增，總共30個循環。反應結束后，將PCR產物跑1.5%瓊脂糖凝膠電泳(120 V，20 min)，凝膠成像系統分析數據。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1 各組TIM-3 的表達 ≤6 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達與對照組無統計學差異(P>0.05)，其他各實驗組TIM-3的表達與對照組均具有統計學差異(P<0.05)。>24 h且≤72 h組血腫周圍組織中TIM-3的表達顯著高于其他各實驗組(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組TIM-3表達(×400)

2.2 各組TIM-3 mRNA的表達 ≤6 h組血腫周圍組織中TIM-3 mRNA的表達與對照組無統計學差異(P>0.05)，其他各實驗組TIM-3 mRNA的表達與對照組均具有統計學差異(P<0.05)。>24 h且≤72 h組血腫周圍組織中TIM-3 mRNA的表達顯著高于其他各實驗組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組TIM-3 mRNA表達

3 討 論

腦出血后血腫對周圍組織產生明顯的壓迫，血腫周圍組織隨之發生一系列變化，凝血酶釋放〔2〕，炎性細胞浸潤〔3〕，補體系統的激活〔4〕，炎癥介質的釋放〔5〕，細胞凋亡〔6〕等機制均參與腦出血后的病理過程。最近的研究〔7〕表明，TIM-3在天然免疫及獲得性免疫均具有重要作用。它不僅表達于Th1細胞、Th17細胞表面，也表達于單核細胞、自然殺傷細胞和樹突細胞等多種細胞表面。TIM-3與其相應的配體半乳凝素-9結合，能負性調節Th1及Th17細胞，減弱其應答，誘導細胞凋亡。

已有研究證實，在腦出血發病6 h后血腫周圍組織中干擾素(IFN)-γ、IL-17的表達增加，提示腦出血發病6 h后Th1及Th17細胞均被動員，分泌細胞因子，參與腦出血后的病理過程〔8〕。本研究提示TIM-3參與腦出血的病理過程，有效地調控TIM-3的表達，可能有效地控制腦出血后的組織損傷。IFN-γ、IL-17的來源可能是除T細胞外的其他細胞。TIM-3也可能表達于膠質細胞等多種除T細胞外的其他細胞，其來源仍需進一步研究。

1 王新德. 各類腦血管疾病診斷要點〔J〕.中華神經科雜志，1996;29(6):379.

2 史 帝，崔桂云.凝血酶在腦出血中作用機制的研究〔J〕. 中國實用神經疾病雜志，2014;17(10):138-40.

3 潘新發. 腦出血后血腫周圍組織炎癥反應的研究進展〔J〕. 國際神經病學神經外科學雜志，2010;37(3):263-7.

4 石明超，李玉玲，吳 江.補體激活與腦出血后繼發腦損傷〔J〕.中風與神經疾病雜志，2010;27(6):568-70.

5 李 萍，趙樹明，胡亞男，等. 腦出血發病機制研究進展〔J〕. 中華老年心腦血管病雜志，2015;17(2):214-5.

6 陳美錟，張 鴻.腦出血與炎癥反應研究進展〔J〕. 遼寧醫學雜志，2014;28(2):88-9.

7 Han G，Chen G，Shen B，etal. Tim-3:an activation marker and activation limiter of innate immune cells〔J〕.Front Immunol，2013;10(4):449.

8 畢 勝.Th17細胞在人腦出血中的作用及機制研究〔D〕.長春：吉林大學，2012.

〔2014-12-19修回〕

(編輯 苑云杰)

黑龍江省自然科學基金項目(H201359);黑龍江省衛生廳項目(2013235)；佳木斯大學校級青年基金項目(Sq 2013-022)

李培育(1980-)，男，碩士，主治醫師，主要從事腦血管病的發病機制研究。

畢 勝(1981-)，女，博士，主治醫師，主要從事腦血管病的發病機制研究。

R743.34

A

1005-9202(2015)12-3201-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.007

1 吉林大學白求恩第一醫院 2 吉林大學白求恩第二醫院