通過RNAi抑制人乳腺癌細胞窖蛋白-1基因表達

張鵬霞 孫寧寧 楊 玉 陳玨曉 柳朝陽

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

通過RNAi抑制人乳腺癌細胞窖蛋白-1基因表達

張鵬霞 孫寧寧1楊 玉 陳玨曉 柳朝陽2

(佳木斯大學基礎醫學院，黑龍江 佳木斯 154007)

目的 通過構建針對窖蛋白(CAV)-1基因的siRNA，研究RNAi技術對MCF-7細胞cav-1基因表達的影響。方法 構建siRNA表達載體pGenesil-1-shRNA-cav-1，通過脂質體法轉染到MCF-7細胞，RT-PCR法檢測cav-1的mRNA表達。結果 成功構建重組表達載體pGenesil-1-shRNA-cav-1；RT-PCR檢測顯示轉染重組質粒的乳腺癌細胞中cav-1 mRNA表達明顯低于陰性對照、空白對照和正常細胞組。結論 重組表達載體pGenesil-1-shRNA-cav-1能有效抑制人乳腺癌細胞cav-1基因的表達。

窖蛋白(cav)-1；siRNA；MCF-7

窖蛋白(cav)-1是胞膜窖的重要組成蛋白，參與膽固醇和脂質的調節和運輸、獨立的蛋白胞吞和胞飲作用及信號轉導的調節〔1〕。cav-1還可以與轉錄因子相互作用，調控相關基因的表達，抑制腫瘤發生。在乳腺癌、前列腺癌、胃癌、肝癌等多種腫瘤細胞中均發現cav-1異常〔2〕，并且與乳腺上皮細胞轉化及乳腺癌的發生密切相關〔3〕。改變cav-1的表達對乳腺癌沉默癌基因、調控細胞周期、抗血管生成、增強放化療敏感性及基因功能研究等有重要意義〔4，5〕。目前針對cav-1基因RNAi的乳腺癌基因治療尚未見報道。本研究構建針對cav-1基因的高效RNAi質粒，為進一步研究cav-1基因在乳腺癌發生發展中的作用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株MCF-7購自中科院上海生命科學研究院。大腸桿菌E.coli DH5α，質粒pGenesil-1(帶有綠色熒光蛋白和卡那霉素抗性)購自武漢晶賽生物工程公司。

LipofectamineTM2000脂質體購自美國Invitrogen公司。RNAiso Plus、RT-PCR試劑盒、Hind Ⅲ、BamH Ⅰ、T4 DNA Ligase購自TaKaRa公司。

引物由TaKaRa公司合成，β-actin引物：5′-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3′、5′-ATCTCCTTCTGCATCCTGTC-3′(擴增片段的長度為251 bp)；cav-1引物：5′-AGACGAGCTGAGCGAGAAG-3′、5′-TGTGGACGTAGATGGAATAGAC-3′(擴增片段的長度為362 bp)；GAPDH引物：5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′、5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′(擴增片段大小為113 bp)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 乳腺癌細胞MCF-7培養于含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養液中，置于37℃、5% CO2及飽和濕度的孵箱中培養。根據細胞生長狀況2～3 d傳代1次，取對數生長期的細胞傳代。

1.2.2 重組質粒pGenesil-1-shRNA-cav-1構建 設計轉錄產物為針對cav-1基因的shRNA的DNA模板，記作cav-1-1、cav-1-2、cav-1-3、cav-1-4、cav-1-5、cav-1-6；通用的陽性對照選擇針對管家基因GAPDH(ID：2597)的shRNA，記作GAPDH；通用的陰性對照選擇經過NCBI中blast比對的與人、鼠的基因皆無同源性的DNA片段，記作YX。合成的DNA鏈經限制性內切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切后與同樣酶切的載體pGenesil-1進行連接，連接產物轉化至DH5α感受態菌，涂于含Kanamycin的LB瓊脂培養基上，觀察菌落生長情況。挑菌進行菌落PCR，提取質粒，進行雙酶切鑒定，陽性菌株送至TaKaRa公司進行測序，測序結果與GenBank源基因比對，序列結果正確無誤。將鑒定后的重組質粒命名為pGenesil-1-cav-1-1、pGenesil-1-cav-1-2、pGenesil-1-cav-1-3、pGenesil-1-cav-1-4、pGenesil-1-cav-1-5、pGenesil-1-cav-1-6、pGenesil-1-GAPDH、pGenesil-1-YX。設置空白質粒組pGenesil-1-KB做對照。

1.2.3 重組質粒pGenesil-1-shRNA-cav-1轉染 轉染前用胰酶消化細胞并計數，接種到6孔板中，每孔3×105個細胞。待細胞匯合度達到70%～80%，采用脂質體法于離體狀態下，用LipofectamineTM2000試劑將質粒pGenesil-1-cav-1-1、pGenesil-1-cav-1-2、pGenesil-1-cav-1-3、pGenesil-1-cav-1-4、pGenesil-1-cav-1-5、pGenesil-1-cav-1-6、pGenesil-1-GAPDH、pGenesil-1-YX、pGenesil-1-KB轉染至MCF-7細胞，同時設置正常細胞組(ZC)作對照。基因轉染6 h后更換為新鮮的含雙抗和10%胎牛血清的DMEM完全培養基繼續培養。48 h后在熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況并作記錄。

1.2.4 RT-PCR法檢測cav-1 mRNA表達 使用RNAiso Plus提取細胞總RNA，用逆轉錄試劑盒將mRNA逆轉錄成cDNA。PCR擴增條件：94℃變性5 min，然后94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸25 s，共35個循環，再72℃反應10 min，4℃終止反應。PCR產物以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 統計學處理 采用SPSS17.0軟件，組間比較采用q檢驗，指標之間的關系采用相關分析。

2 結 果

2.1 重組質粒表達載體的測序結果 重組后質粒進行雙酶切鑒定，陽性菌株送至TaKaRa公司進行測序，測序結果與GenBank源基因比對，序列正確無誤。

2.2 熒光電子顯微鏡下質粒轉染情況 轉染48 h后倒置熒光顯微鏡觀察，視野內有較強的綠色熒光，證明有綠色熒光蛋白EGFP表達，說明各表達載體成功轉染入MCF-7細胞中，見圖1。

2.3 cav-1基因表達情況 轉染重組質粒pGenesil-1-cav-1-1、pGenesil-1-cav-1-2、pGenesil-1-cav-1-3、pGenesil-1-cav-1-4、pGenesil-1-cav-1-5、pGenesil-1-cav-1-6組乳腺癌細胞中cav-1基因的mRNA表達(0.576±0.013,0.593±0.021,0.559±0.017,0.617±0.020,0.561±0.015,0.588±0.014)明顯低于陰性對照YX(0.739±0.023)、空白對照KB(0.834±0.029)和正常細胞ZC(0.918±0.016),見圖2。

圖1 重組質粒轉染后結果

M：Marker，1：cav-1-1，2：cav-1-2，3：cav-1-3，4：cav-1-4，5：cav-1-5，6：cav-1-6，7：GAPDH，8：YX，9：KB，10：ZC

3 討 論

乳腺癌的發病與多種遺傳學改變有關。管海濤等〔6〕利用RNAi技術，對乳腺癌細胞的survivin基因進行研究，發現癌細胞的增殖被抑制，12.9%癌細胞被誘導凋亡。乳腺癌基因治療策略面臨的難題之一是乳腺癌發病呈現多個癌基因與抑癌基因共同作用的復雜過程，而臨床治療可供篩選的新基因較少。目前的研究傾向認為cav-1可能是癌基因，理由是在很多腫瘤組織發現cav-1表達升高，也包括部分腫瘤細胞系。Abedelnasser等〔7〕的研究發現，cav-1表達在膠質母細胞瘤細胞株被上調，與此相反，在膠質母細胞瘤細胞株，cav-3與cav-2表達被下調。Patlolla等〔8〕研究發現，與相鄰正常組織比較，cav-1在結腸癌組織中發生過度表達，并且與癌細胞生長率直接相關。Kim等〔9〕研究發現，cav-1在結直腸癌組織高表達，并且cav-1途徑可以通過不依賴EGFR的方式影響Akt的活化。但是也有部分研究認為cav-1具有抑制癌癥發生的作用，馬微等〔10～12〕研究發現在白血病中cav-1為抑癌基因。

質粒載體pGenesil-1是以pEGFP-C1質粒為骨架改造獲得的。pEGFP-C1質粒廣泛用于哺乳動物細胞已經多年，具有熒光蛋白表達，非常方便導入效果的檢測，同時帶有多個酶切位點。本實驗結果證實，重組表達載體pGenesil-1-shRNA-cav-1能夠有效抑制MCF-7細胞 CAV-1基因的表達。

1 Couet J，Li S，Okamoto T，etal.Identification of peptide and protein ligands for the caveolin-scaffolding domain.Implications for the interaction of caveolin with caveolae-associated proteins〔J〕.J Biol Chem，1997；272(10)：6525-33.

2 張惠球，劉奕生，沈浩賢.Caveolin-1蛋白在乳腺癌組織中的表達及意義〔J〕.中國醫藥指南，2010；8(10)：32-3.

3 王 洋，封 爽，鄒 偉.窖蛋白-1、基質金屬蛋白酶-2與乳腺腫瘤的侵襲和轉移〔J〕.中國生物化學與分子生物學報，2010；26(4)：311-4.

4 Sofou S，Sgouros G.Antibody-targeted liposomes in cancer therapy and imaging〔J〕.Expert Opin Drug Deliv，2008；5(2)：189-204.

5 黃坤寨，蔡建春.RNA干擾原理及其在腫瘤研究中的應用〔J〕.醫學綜述，2010；16(1)：72-4.

6 管海濤，薛興歡，王西京，等.靶向survivin的siRNA抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖并誘導其凋亡〔J〕.中華腫瘤雜志，2008；31(5)：532-6.

7 Abedelnasser A，Sabina G，Moises F A.Interactions of EGFR and caveolin-1 in human glioblastoma cells：evidence that tyrosine phosphorylation regulates EGFR association with caveolae〔J〕.Oncogene ，2004;23(41)：6967-79.

8 Patlolla JM，Swamy MV，Raju J，etal.Overexpression of caveolin-1 in experimental colon adenocarcinomas and human colon cancer cell lines〔J〕.Oncol Rep，2004;11(5)：957-63.

9 Kim HA，Kim KH，Lee RA.Expression of caveolin-1 is correlated with Akt-1 in colorectal cancer tissues〔J〕.Exp Mol Pathol,2006;80(2)：165-70.

10 Ma W，Wang D，Li L，etal.Caveolin-1 plays a key role in Oleanolic acid-induced apoptosis of HL-60 cells〔J〕.Oncol Rep,2014;32(1)：293-301.

11 馬 微，王迪迪，王 昭，等.慢病毒介導的CAV1過表達對HL-60細胞增殖與凋亡的影響〔J〕.中國實驗血液學雜志，2013；21(4)：905-10.

12 馬 微，李 麗，楊永旭，等.CAV-1基因在五種白血病細胞中的表達〔J〕.中國老年學雜志，2013;33(19)：4754-6.

〔2015-01-17修回〕

(編輯 李相軍)

Inhibiting the expression of cav-1 gene in human breast cancer cell lines by siRNA

ZHANG Peng-Xia,SUN Ning-Ning,YANG Yu,etal.

Basic Medical College of Jiamusi University,Jiamusi 154007,Heilongjiang,China

Objective To construct a new siRNA targeting to cav-1 applied to regulate the expression of cav-1 of MCF-7 cell lines.Methods The expression carrier pGenesil-1-shRNA-cav-1 was constructed,then the carrier was transfected into MCF-7 cell lines. The expression of cav-1 mRNA was detected by reverse transcription PCR.Results It was successful to contruct the recombinated expression carrier pGenesil-1-shRNA-cav-1. The expression of cav-1 mRNA in breast cells transfected recombination plasmids was obviously lower than the one in negative control,blank control and normal cells.Conclusions Recombinated carrier pGenesil-1-shRNA-cav-1 could effectively inhibit the expression of cav-1 in human breast cancer cell lines.

Cav-1;siRNA;MCF-7

國家自然科學基金資助項目(81070428)；黑龍江省教育廳科學技術研究面上項目(12521533)；黑龍江省衛生廳項目(2009-336)；佳木斯大學研究生科技創新理科重點項目(LZZ2014_006)；佳木斯大學校級交叉學科研究項目(jc2014-001)。

張鵬霞(1967-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事抗腫瘤機制及藥物的研究。

R737.9

A

1005-9202(2015)12-3194-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2015.12.004

1 威海紐普生物技術有限公司 2 佳木斯大學臨床醫學院