銀杏內酯B抑制高糖誘導內皮細胞TLR4及炎癥蛋白表達

孫文佳，孫 杰，陳北冬，趙艷陽，齊若梅

(衛生部北京醫院/老年醫學研究所，衛生部老年醫學重點實驗室，北京 100730)

銀杏內酯B抑制高糖誘導內皮細胞TLR4及炎癥蛋白表達

孫文佳，孫 杰，陳北冬，趙艷陽，齊若梅

(衛生部北京醫院/老年醫學研究所，衛生部老年醫學重點實驗室，北京 100730)

目的 評價銀杏內酯B對高糖誘導內皮細胞TLR4表達的影響以及分子機制。方法 使用人原代臍靜脈內皮細胞，用高糖刺激內皮細胞，用Western blot分析TLR4、炎癥蛋白表達以及Akt 磷酸化。免疫熒光檢測NF-κB核轉位。結果 高糖(30 mmol·L-1)刺激內皮細胞TLR4和PAF受體表達明顯增加，PAF受體抑制劑銀杏內酯B (0.6 g·L-1) 和CV3988(30 μmol·L-1)分別抑制了TLR4及PAF受體表達。銀杏內酯B有效地抑制了高糖刺激內皮細胞ICAM-1、VCAM-1表達。分子機制的研究表明，銀杏內酯B明顯抑制了高糖誘導的Akt磷酸化,以及NF-κB p65的核轉位。結論 高糖刺激內皮細胞TLR4和PAF受體表達增高，銀杏內酯B能夠抑制高糖刺激TLR4、PAF受體和炎癥蛋白表達，分子機制與抑制Akt磷酸化以及NF-κB活化相關。

銀杏內酯B；TLR4；PAF 受體；內皮細胞；高糖；Akt；NF-κB

Toll樣受體 (toll like receptor, TLR)是Ⅰ型跨膜受體，能夠識別外來微生物侵入，激活免疫應答反應。TLR為模式識別受體，在天然免疫免疫應答反應中起關鍵作用[1]。近來研究表明，TLR不僅能夠識別外來的病原體[2]，在糖尿病并發癥、心血管疾病過程中也發揮重要作用[3-5]。TLR家族包含13個成員， TLR4是目前研究最廣泛的TLR家族成員之一，且與糖尿病并發癥發生密切相關。臨床研究表明，糖尿病患者的TLR4表達水平增高[6-7]，但分子機制尚不完全清楚。

銀杏內酯B是銀杏葉提取物，是天然的血小板活化因子受體(platelet activating factor receptor, PAFR)拮抗劑，它通過與PAF受體競爭性結合抑制PAF介導的血小板活化[8]。大量研究顯示，銀杏內酯B對內皮細胞、神經細胞均有較好的保護作用[9-10]。然而，銀杏內酯B是否能夠對高糖誘導的內皮細胞損傷有保護作用尚不清楚。PAF受體是一類G蛋白偶聯受體, 介導炎癥細胞、血小板的活化過程，在多種細胞中都有表達，包括內皮細胞[11]。內皮細胞損傷及功能障礙是糖尿病血管病變中的早期表現, 本研究旨在探討銀杏內酯B對高糖誘導內皮細胞TLR4、炎癥蛋白表達的影響以及相關的分子機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑銀杏內酯B 購自江蘇大觀園商貿公司，純度為95% ( 批號: BAT2007115)。Ⅰ型膠原酶、明膠購自Sigma 公司; 胰蛋白酶、特級胎牛血清購自Hyclone公司;Medium 199 培養基購自Gibco (Invitrogen 公司)；葡萄糖購自Amresco公司；抗TLR4 抗體購自Abcam 公司;抗PAF Receptor 抗體購自Cayman Chemical公司；抗ICAM-1、VCAM-1、β-actin 抗體購自Santa Cruz 公司; 抗NF-κB p65抗體、抗Akt 和phospho-Akt 抗體購自Cell Signaling 公司；辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG、兔抗山羊IgG購自北京中杉金橋公司；Dylight-549標記的山羊抗兔IgG購自 Earthox 公司。

1.2 人臍靜脈內皮細胞的分離與培養取新鮮臍帶，用Ⅰ型膠原酶(1 g·L-1)灌注到臍靜脈20 min, 收集灌注液、離心。將分離的內皮細胞于M199培養基中培養，含20%的特級胎牛血清，1%青霉素和鏈霉素，在含5% CO2的37℃培養箱中培養，細胞傳至第3代用于實驗。

1.3 Western blot 方法檢測蛋白表達用葡萄糖(30 mmol·L-1) 刺激內皮細胞 8 h。去除培養基后，用細胞裂解液RIPA(購自碧云天生物技術公司)裂解細胞，收集蛋白。采用BCA法測定蛋白濃度。取15 μg 蛋白樣品，經SDS-PAGE 電泳、轉膜。用5%的牛血清白蛋白溶液封閉1 h。分別加入特異性的抗體(TLR4、PAFR、ICAM-1、VCAM-1、phospho-Akt、Akt)，4℃孵育過夜。用TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入對應二抗，室溫孵育1 h。洗膜3次，每次5 min。加入ECL 發光液，用VILBER LOURMAT凝膠成像儀成像。

1.4 免疫熒光檢測NF-κB 的核轉位將滅菌玻片置于24孔板中，接種人臍靜脈內皮細胞。待細胞鋪滿玻片時用于實驗。加入0.6 g·L-1銀杏內酯B 孵育1 h，再加入30 mmol·L-1葡萄糖刺激細胞8 h。用PBS洗3次，用4%多聚甲醛固定細胞20 min。用PBS洗3次，用5%牛血清白蛋白封閉2 h, 加入抗NF-κB抗體(1 ∶50)孵育，4℃過夜。PBS洗3次，加入Dylight-549標記的二抗(1 ∶100)，室溫下避光孵育1 h, 加入DAPI (1 ∶1 000) 孵育10 min，用于細胞核染色。用50%甘油封片。使用Olympus BX60熒光顯微鏡觀察細胞，用尼康CCD成像系統采集圖像。

2 結果

2.1 高糖刺激內皮細胞TLR4和PAF受體的表達為了探明高糖對內皮細胞TLR4與PAF 受體表達的影響，我們首先觀察了不同濃度(0、5、10、20、30 mmol·L-1)葡萄糖刺激內皮細胞TLR4和PAF 受體表達的變化。結果顯示，TLR4表達、PAF 受體表達均隨著葡萄糖濃度的升高而增加，呈劑量依賴關系，30 mmol·L-1葡萄糖刺激細胞時TLR4表達、PAF 受體均達到較高的水平(Fig 1A)。進而，我們觀察了葡萄糖刺激內皮細胞TLR4、PAF 受體表達隨時間變化的過程。結果顯示，高糖刺激內皮細胞4 h和8 h時，TLR4和PAF 受體表達均達到高峰，16 h后表達逐漸降低，二者出現了相同的變化趨勢(Fig 1B)。

Fig 1 TLR4 and PAF receptor expression induced by glucose

A: TLR4 and PAF receptor expression induced by various concentrations of glucose; B: TLR4 and PAF receptor expression induced by glucose at different time.

2.2 抑制PAF受體對內皮細胞TLR4和PAF受體表達的影響為了探討PAF受體抑制劑是否對

TLR4及PAF受體表達有抑制作用，我們觀察了銀杏內酯B對高糖刺激內皮細胞TLR4 及PAF受體表達的影響。使用不同濃度的銀杏內酯B(0.2、0.4、0.6 g·L-1)處理細胞，觀察對TLR4及PAF受體表達的影響。結果表明，葡萄糖刺激內皮細胞8 h后，TLR4表達增加了23%，PAF受體表達增加了41%，銀杏內酯B以劑量依賴性的方式抑制了高糖誘導的TLR4及PAF受體表達 (Fig 2A、B)。然后，我們使用了另一個PAF 受體抑制劑CV3988，觀察其對內皮細胞TLR4及PAF受體表達的影響，CV3988同樣以劑量依賴性的方式抑制了高糖刺激的TLR4及PAF受體表達(Fig 2 C、D)。

2.3 銀杏內酯B對高糖刺激內皮細胞炎癥蛋白ICAM-1、VCAM-1表達的影響高糖能夠導致內皮細胞損傷，表現為內皮細胞的炎癥蛋白表達增高。本研究評價了銀杏內酯B對高糖刺激內皮細胞黏附蛋白(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管細胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)表達的影響。結果顯示，高糖刺激8 h內皮細胞ICAM-1 增加了35%，VCAM-1表達增長了42%。銀杏內酯B(0.6 g·L-1)幾乎完全抑制了ICAM-1、VCAM-1的表達 (Fig 3)。

2.4 銀杏內酯B對高糖刺激內皮細胞Akt磷酸化的影響PI3K/Akt通路參與細胞的多種活化反應，本研究觀察了高糖刺激內皮細胞對Akt磷酸化的影響。結果表明，高濃度葡萄糖(30 mmol·L-1)刺激后，內皮細胞信號分子Akt磷酸化水平增加了34%，銀杏內酯B以劑量依賴的方式抑制了Akt磷酸化(Fig 4)。

2.5 銀杏內酯B對高糖刺激內皮細胞NF-κB 核轉位的影響研究已經表明，炎癥狀態下核轉錄因子NF-κB 的亞基p65移位到細胞核，與靶基因結合，啟動炎癥蛋白表達。本研究利用免疫熒光的方法觀察了高糖刺激內皮細胞的NF-κB p65核轉位。結果顯示，未用高糖處理的細胞NF-κB p65主要在細胞質表達，當30 mmol·L-1葡萄糖刺激內皮細胞8 h，NF-κB p65在細胞質中表達減少，而在細胞核表達明顯增多，提示NF-κB p65發生核轉位 。銀杏內酯B(0.6 g·L-1)處理的細胞，NF-κB p65的核轉位現象被完全抑制(Fig 5)。

3 討論

近來研究表明，糖尿病過程中伴有機體免疫功能失調，然而，其機制尚不完全清楚[12]。TLR4是一類進化上非常保守的受體，主要識別革蘭陰性桿菌內毒素脂多糖(LPS)，在脂肪組織、骨骼肌、內皮細胞中均有表達[13-15]。TLR4介導的信號能激活轉錄因子NF-κB活化,從而誘導炎癥蛋白的合成，如ICAM-1、VCAM-1[16]。近年來有研究發現，糖尿病中胰島素抵抗誘導的炎癥反應與TLR4有關[17]。同樣的現象也存在于糖尿病伴有的動脈粥樣硬化。動物實驗研究表明TLR4基因缺失有助于減輕動脈粥樣硬化病變程度[18]。

Fig 2 Effects of ginkgolide B and CV3988 on TLR4 and PAF receptor expression in glucose-treated HUVECs

A, B: Ginkgolide B inhibited the expression of TLR4 and PAF receptor in high dose of glucose-treated HUVECs. C, D: CV3988 inhibited the expression of TLR4 and PAF receptor in high dose of glucose-treated HUVECs. Data are representatives of four independent experiments.#P<0.05 compared with cells without glucose treatment;*P<0.05 compared with cells treated with glucose alone.

Fig 3 Effect of ginkgolide B on ICAM-1 and VCAM-1 expression in glucose-treated HUVECs

A, B: Ginkgolide B inhibited the expression of ICAM-1 in high glucose-treated HUVECs. C, D: Ginkgolide B inhibited the expression of VCAM-1 in high glucose-treated HUVECs. Data are representatives of four independent experiments.#P<0.05 compared with cells without glucose treatment;*P<0.05 compared with cells treated with glucose alone.

Fig 4 Effect of ginkgolide B on Akt phosphorylation in glucose-treated HUVECs

A: Western blot analysis of Akt phosphorylation; B: Densitometry analysis of Akt phosphorylation. Data are representatives of four independent experiments.#P<0.05 compared with cells without glucose treatment;*P<0.05 compared with cells treated with glucose alone.

PAF是一個強有力的炎癥介質，通過與PAF受體結合參與機體多種炎癥反應[19]。本研究我們發現，高糖刺激增加內皮細胞TLR4表達，同時PAF受體表達也明顯增高。這一現象提示PAF受體參與了高糖誘導的TLR4活化反應。我們提出的問題是，抑制PAF受體介導的信號通路是否能夠同時抑制TLR4介導的炎癥反應。因此，我們使用了PAF受體抑制劑銀杏內酯B，觀察其對高糖誘導的內皮細胞TLR4及PAF受體表達，以及相關的炎癥反應的影響。本研究的結果提示，銀杏內酯B能夠降低高糖誘導的TLR4及PAF受體高表達。我們使用另一個PAF受體抑制劑CV3988處理細胞獲得了同樣的結果。本研究還發現，高糖刺激TLR4表達增高后，ICAM-1、VCAM-1表達隨之增高，而銀杏內酯B同樣抑制了這些炎癥蛋白的表達。此外，我們發現銀杏內酯B抑制了高糖誘導NF-κB p65核轉位，表明銀杏內酯B能夠抑制高糖刺激的NF-κB通路活化。先前我們的研究發現,銀杏內酯B能夠抑制ox-LDL刺激內皮細胞的Akt磷酸化[20]。本研究發現，高糖能夠增高內皮細胞Akt磷酸化水平，而銀杏內酯B有效地抑制高糖刺激的Akt磷酸化。

綜上所述，銀杏內酯B能夠降低高糖刺激內皮細胞TLR4及PAF受體表達，并抑制內皮細胞的炎癥反應。銀杏內酯B的藥理作用可能不僅與其拮抗PAF受體相關，而是通過影響多個信號分子發揮作用的。這些結果為今后糖尿病動脈粥樣硬化的防治研究提出了一個新的實驗依據，具有重要的科學意義。

Fig 5 Effect of ginkgolide B on NF-κB p65 nuclear translocation in glucose-treated HUVECs The red fluorescence represents NF-κB p65. The blue fluorescence represents nucleus.

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Effect of ginkgolide B on TLR4 and inflammatory protein expression in high glucose treated human umbilical vein endothelial cells

SUN Wen-jia, SUN Jie, CHEN Bei-dong, ZHAO Yan-yang, QI Ruo-mei

(BeijingInstituteofGeriatrics,BeijingHospital,KeyLaboratoryofGeriatrics,MinistryofHealth,Beijing100730,China)

Aim To investigate the effect of ginkgolide B on TLR4 expression in glucose-treated endothelial cells. Methods Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were stimulated by high concentration of glucose. TLR4, inflammatory protein expression and Akt phosphorylation were analyzed by Western blot. Transcription factor NF-κB nuclear translocation was analyzed by immunofluorescence. Results The expression of TLR4 and PAF receptor was increased in high glucose-treated HUVECs. In contrast, both ginkgolide B and CV3988 dose-dependently decreased TLR4 and PAF receptor expression in high glucose-treated cells, respectively. Ginkgolide B decreased inflammatory protein ICAM-1, VCAM-1 expression. Moreover, ginkgolide B potently abolished Akt phosphorylation and NF-κB p65 nuclear translocation. Conclusion Ginkgolide B can reduce TLR4, PAF receptor, ICAM-1 and VCAM-1 expression in high dose of glucose-treated HUVECs, the mechanism might be linked to inhibition of Akt phosphorylation and NF-κB activation.

ginkgolide B; TLR4; PAF receptor; endothelial cells; high glucose; Akt; NF-κB

時間：2015-4-15 15:44 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150415.1545.007.html

2014-12-01,

2015-01-07

國家自然科學基金資助項目(No 81070231, 81270379, 81471051)

孫文佳(1988-)，男，碩士生，研究方向：心血管疾病基礎，Tel：010-58115047，E-mail:wenjiasun@msn.com; 齊若梅(1957-)，女，博士，研究員，博士生導師，研究方向：動脈粥樣硬化、血栓學的分子機制，通訊作者，Tel: 010-58115047，E-mail: ruomeiqi@163.com

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.05.010

A

1001-1978(2015)05-0636-05

R284.1；R322.123；R341；R392.11；R364.5