流感病毒RNA聚合酶PA亞基：潛在抗流感藥物靶點

連雯雯，劉艾林,2,3，杜冠華,2,3

(1．中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，2．藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室；3．天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

◇講座與綜述◇

流感病毒RNA聚合酶PA亞基：潛在抗流感藥物靶點

連雯雯1，劉艾林1,2,3，杜冠華1,2,3

(1．中國醫學科學院北京協和醫學院藥物研究所，2．藥物靶點研究與新藥篩選北京市重點實驗室；3．天然藥物活性物質與功能國家重點實驗室，北京 100050)

流感是世界范圍內的嚴重傳染性疾病，目前抗流感藥物面臨的主要問題是病毒耐藥性和對高致病性流感病毒的效價低。流感病毒RNA聚合酶是病毒在宿主細胞內完成復制和轉錄過程的關鍵性酶，其中PA亞基通過內切酶活性為流感病毒的轉錄過程提供引物，成為潛在抗流感藥物靶點。該文對PA亞基的結構、功能及內切酶抑制劑類抗流感藥物研究進展進行概述，為PA亞基的深入研究及針對此靶點的抗流感藥物發現提供信息指導。

流感病毒；PA亞基氨基端；PA亞基羧基端；內切酶；金屬離子結合位點；高通量篩選模型

流行性感冒(簡稱流感)是全球性嚴重傳染性疾病，每年大約有20%的兒童和5%的成年人患有伴隨臨床癥狀的甲型或乙型流感。目前用于預防和治療流感的化學藥物僅有兩種類型：M2離子通道抑制劑(amantadine和rimantadine)和NA抑制劑(zanamivir和oseltamivir)。這兩類藥物面臨的最大問題是病毒耐藥性問題，特別是M2離子通道抑制劑由于出現廣泛耐藥性而不被推薦用于臨床[1-3]，其次這兩類藥物對高致病性流感病毒如H5N1的效果不理想。近幾年，高致病性禽流感病毒H5N1頻頻出現，發現高效、廣譜的抗流感藥物成為新藥研發緊迫而重要的任務。

流感病毒進入宿主細胞后，在細胞核內完成復制(vRNA-cRNA-vRNA)和轉錄(vRNA-mRNA)過程，這兩個過程都是由流感病毒編碼的RNA聚合酶催化。RNA聚合酶由PB1、PB2和PA亞基組成，PB1亞基主要參與病毒基因組的復制過程；PB2亞基主要負責與宿主pro-mRNA帽狀結構結合，協助完成內切酶的剪切過程；而關于RNA聚合酶內切酶活性存在PB1還是PB2亞基的問題一直存在爭議，直到2009年Yuan和Dias兩個課題組同時揭示PA亞基氨基端的晶體結構，并確認RNA聚合酶的內切酶活性存在于PA亞基的氨基端，結束了關于內切酶活性存在哪個亞基的爭論。由于病毒蛋白質的合成依賴宿主細胞的翻譯體系，流感病毒mRNA需要同時具備可供宿主細胞翻譯體系識別的5′帽狀結構和3′-poly(A)尾，其中5′帽狀結構是通過RNA聚合酶PA亞基的內切酶活性從宿主細胞pro-mRNA的5′端剪切得到的10～13個核苷酸(即cap-snatching)[4-5]，是流感病毒轉錄起始所必須的。cap-snatching是流感病毒生命周期中的一個關鍵事件，宿主細胞中不存在類似的事件和相應的酶，因此針對cap-snatching的內切酶抑制劑可以選擇性阻斷流感病毒的轉錄過程，對宿主細胞不造成影響，同時PA亞基氨基端和羧基端晶體結構的揭示，以及氨基酸序列的高度保守性，使PA亞基成為潛在的抗流感藥物靶點。本文對PA亞基的結構、功能及內切酶抑制劑類抗流感藥物研究進展進行概述，為PA亞基的深入研究及針對此靶點的抗流感藥物發現提供信息指導。

1 RNA聚合酶PA亞基的結構

流感病毒RNA聚合酶以PB1亞基為中心，PA亞基的C端和PB2亞基的N端分別與PB1亞基的N端和C端結合，構成RNA聚合酶，后者與核蛋白、vRNA一起構成核糖核蛋白體RNP[5-7]。流感病毒的基因組是由8個單負鏈RNA片段組成，PA亞基由第3個RNA片段編碼，含有716個氨基酸，分子質量約為83.4 ku，在胰蛋白酶的作用下，可以被水解為2個片段：N端約為25 ku的結構域(氨基酸殘基1～212或213，簡稱PAN)和C端約為55 ku的結構域(氨基酸殘基212或213～716，簡稱PAC)[6]。

1.1 PA亞基氨基端的結構PAN含有1個由α螺旋和β片層構成的結構域，即7個α螺旋環繞著5個反向β片層構成的曲面，內部含有帶負電的活性口袋，可能參與二價陽離子的結合。PAN屬于PD-(D/E)XK超家族，內切酶活性位點可能位于P107D108X10E119K134[8-9]。由于結晶條件不同，Yuan等[8]的結構中，PAN與1個鎂離子結合，結合位點由E80、D108及與H41、E119、L106、P107結合的3個水分子組成，而Dias等的結構中，PAN與2個錳離子結合，結合位點包括site1：E119，D108及兩個水分子和site2：H41、D108、E119及I120[9]。PAN的三維結構及可能的金屬結合位點的詳細描述如Fig 1所示。

Fig 1 The three dimentional structure and mental binding sites of PAN

1.2 PA亞基羧基端的結構PAC通常和PB1亞基N端(PB1N)結合，兩者共結晶的結構顯示，PAC由13個α螺旋和9個β片層組成，包括兩個結構域(domain 1和domain 2)，domain 1由5個α螺旋(α1、α2、α3、α6、α7)環繞7個β片層(β1～β7)組成，domain 2由片層β8、β9及螺旋α4、α5、α8-α12組成，形狀似一個開口的鉗子，α8和α10組成開口的上沿，α11和α13組成開口的下沿。PB1N的15個氨基酸以N端朝里，C端朝外的方式與domain 2以氫鍵、疏水作用和范德華力結合。domain 2的鉗狀開口一直延伸，在domain 1上形成一道槽，該槽附近以堿性氨基酸為主，帶大量的負電荷，可能與vRNA或cRNA的結合有關[10-11]。PAC的三維結構的詳細描述見Fig 2。

2 PAN的內切酶活性

根據文獻報道，PA亞基具有多種功能，如內切酶活性、蛋白水解酶活性、介導PB1亞基和RNA的相互作用等，下面主要對研究較為深入的內切酶活性做簡要的概括。

2009年,Yuan和Dias首次確定RNA聚合酶的內切酶活性是存在PAN，并揭示PAN晶體結構。對酶活性中心進行分析，Dias等[9]通過同源序列比對的方式，獲得的PAN活性中心的關鍵氨基酸殘基有H41、D108、E119、K134；Yuan等[8]對PAN進行點突變，包括E80A、D108A、E119A、K134A，研究發現，帶有這些點突變的RNA聚合酶能選擇性抑制流感病毒mRNA的合成，而對cRNA和vRNA的合成沒有影響，推測E80、D108、E119、K134可能是內切酶活性中心的關鍵氨基酸殘基。

內切酶活性的發揮需要二價陽離子的輔助，目前研究者廣泛接受兩個錳離子結合機制。Yuan等[8]在0.1 mol·L-1MgCl2條件下結晶得到的PAN與1個鎂離子結合，鎂離子的結合位點是site2；Dias等[9]在2.5×10-3mol·L-1MnCl2和5×10-3mol·L-1MgCl2條件下得到的PAN與2個錳離子結合。Zhao等[12]獲得PAN與單磷酸核苷酸的晶體結構中，鎂離子位于site 2；Kowalinski等[13]得到PAN與單磷酸核苷酸的晶體結構中，活性中心存在2個錳離子，這種差異可能是由結晶環境不同造成。Crépin等[14]通過等溫滴定法發現，PAN存在兩個離子結合位點，這些位點對錳離子的親和力是鎂離子的500～600倍，同時PAN與錳離子的結合是放熱過程，而與鎂離子的結合是吸熱過程，推測PAN傾向與錳離子結合。Noble等[15]報道，在不同的二價陽離子存在下，PA具有不同的構象，同時對底物的剪切模式也不同。此外，DouBis等[16]、Doan等[17]發現，在相同離子濃度下，RNP和PAN與錳離子結合后，內切酶活性和酶穩定性都明顯高于與鎂離子結合。Xiao等[18]應用分子動力學模擬技術發現，在沒有底物的情況下，鎂離子傾向與PAN的site1結合，而在底物RNA存在情況下，PAN傾向與2個鎂離子結合，催化剪切反應[18]。因此，PAN結構中結合的金屬離子的種類和數目與環境中的金屬離子有關，雖然有實驗表明，PAN與錳離子結合的親和力較高，且結合后具有較高內切酶活性和穩定性，但是在鎂離子濃度(毫摩爾級)遠高于錳離子(微摩爾級)的生理環境中，作者認為鎂離子可能是PAN的天然輔助因子，但是最終結論還有待于進一步研究。

Fig 2 The three dimentional structure of PAC-PB1N complex

The three dimensional structure of PAC-PB1Ncomplex is in ribbon representation, and the yellow helix is PB1N, the rest PAC. The structure of PACis colored by different secondary structures: α-helices are red, β-sheets are cyan, and the linkers are slivery. The individual secondary structures are labelled. There are two domains in the structure, and the left part is domain 1, the right domain2(PDB ID 3CM8).

在底物選擇性方面，PAN是廣譜的核酸內切酶，對單鏈DNA和RNA都具有剪切作用，但對不同底物具有不同的剪切活性和剪切模式。Klumpp等[19]發現內切酶剪切單鏈DNA的活性比RNA低，推測可能是底物的不同結構化程度導致的。Dias等[9]研究了PAN對不同結構化程度單鏈RNA的剪切活性，結果顯示PAN對高度結構化的RNA如tRNA和AluRNA，基本不表現剪切活性；對部分結構化的RNA如ph-RNA有一定的剪切活性，將RNA剪切成較大的片段；而對無結構的RNA如U-richRNA，表現出較強的剪切活性，可以將RNA剪切成較小的片段。Noble等[15]發現不同毒株的PA亞基的內切酶活性雖然存在明顯的差異，但是對同一底物的剪切模式相同；而且同一毒株的PA亞基內切酶活性雖然比RNA聚合酶低，但是兩者對同一底物的剪切模式也相同。Datta等[20]發現PA的內切酶活性具有序列特異性，傾向在鳥苷酸的3′端剪切，如果帽結構下游第10～13堿基處沒有鳥苷酸，剪切發生在第12個堿基的3′端；如果帽結構下游第10～13堿基處有鳥苷酸，剪切就發生在鳥苷酸的3′端。

3 以PA亞基內切酶活性為靶點的抗流感藥物研究進展

根據文獻報道，針對PA亞基內切酶活性已開展大量研究工作，并取得一定成果。較為常用的內切酶抑制劑模型主要是體外帽依賴性轉錄酶活性檢測和體外核酸水解活性檢測，由于這兩種方法需要電泳檢測結果，不適用于高通量篩選。Baughman等[21]利用競爭性熒光極化方法建立內切酶抑制劑高通量篩選模型，通過檢測極化光強度的變化，篩選能夠與PAN特異性抑制劑競爭結合到PAN活性中心的化合物，作者利用該模型篩選得到具有內切酶抑制作用的4,5-二羥基嘧啶衍生物。張國防等[22]利用熒光共振能量轉移方法建立內切酶抑制劑高通量篩選模型，通過檢測熒光強度的變化，篩選能抑制內切酶剪切活性的化合物。本實驗室基于內切酶對單鏈DNA的剪切原理，利用DNA熒光染色的方法，建立了內切酶抑制劑篩選模型，此模型簡單、快速、穩定、經濟，適用于化合物的高通量篩選，并利用此模型發現了一些具有活性內切酶抑制作用的化合物[23]。

Tab 1 Classification of endonuclease inhibitors and their representative compounds

此外，虛擬篩選技術在內切酶抑制劑的篩選中也得到了很好的應用，Yan等[24]應用3D-QSAR建模、骨架遷移、分子對接等手段設計得到13個化合物，這些化合物能夠與酶活性中心較好地結合，但缺乏具體實驗驗證。Chen等[25]通過建立藥學團模型，對ChenBridge Express Pick 數據庫進行篩選，獲得了16個涉及5種結構的化合物，這些化合物具有較強的內切酶抑制作用(IC500.74×10-6～46×10-6mol·L-1)，但細胞水平上對流感病毒的抑制作用參差不齊，有待于進一步優化。

基于內切酶抑制劑篩選模型、或虛擬篩選得到的、在細胞水平具有抗流感作用的內切酶抑制劑有很多，涉及多種結構，包括：4,5-二羥基嘧啶衍生物[21]、4-取代2,4-二氧丁酸衍生物[26-27]，2,6-二酮吡嗪類天然產物flutimide[28]、N-羥基酰亞胺衍生物[29]、地錢素[30]、沙利度胺衍生物[31]、C60衍生物[32]、3-羥基喹啉類化合物[33]，EGCG和EGC[34]，THC-19[35]等，詳細的結構信息見Tab 1。雖然這些化合物由于活性有限或毒性較大而未進入臨床研究，結構生物學的發展為這些化合物的進一步優化、新化合物的設計提供重要信息。

DoBois等[16]和Kowalinski等[13]分別利用結構生物學獲得多種內切酶抑制劑與H5N1、H1N1的PAN的晶體結構，發現化合母核上的羥基主要與酶活性中心的錳離子結合，而其他取代基則通過氫鍵或π鍵疊加，與酶活性中心中的疏水口袋相互作用，并指出內切酶抑制劑的強度可能與其結合的口袋數目有關，在優化內切酶抑制劑時應該盡可能通過增加取代基，增強化合物與酶活性中心疏水口袋的結合。Stevaert等[36]在DoBois和Kowalinski實驗結果的基礎上，進一步對參與L-742001結合的疏水口袋中及附近的氨基酸殘基進行點突變，分析不同氨基酸殘基在內切酶活性和抑制劑結合中的貢獻，進而發現了一些同時參與內切酶活性和抑制劑結合的氨基酸殘基(T20、T24、A37、T38、R84、V122、Y130)，但是突變這些氨基酸殘基后對內切酶活性和抑制劑活性影響不大，因此內切酶抑制劑優化時應該考慮加強抑制劑與這些氨基酸殘基的作用，提高抑制劑活性的同時又可以防止耐藥性的產生。根據DoBois和Kowalinski實驗中獲得的經驗，即3個共平面的氧原子可以與酶活性中心的2個錳離子形成相互作用，Carceli等[37]設計了2-羥基苯甲酰胺母核，對其進行取代，分析不同化合物的內切酶抑制作用和其與內切酶活性中心的相互作用，最終確認DoBois和Kowalinski提出的理論，并建議2-羥基苯甲酰胺作為內切酶抑制劑的母核。這些結構信息將加快以PA亞基內切酶活性為靶點的抗流感藥物的研究進程。

4 展望

流感病毒的基因組是由8個單負鏈RNA片段組成，在復制中極易發生突變和重組，導致耐藥性的出現。在治療流感時針對流感病毒生命周期的多個靶點聯合給藥，不僅可以提高抗流感的藥效，而且可以減少耐藥性的產生。然而，目前臨床上可用于流感預防和治療的藥物主要是神經氨酸酶抑制劑，因此，針對不同靶點進行抗流感藥物研發，有利于豐富抗流感藥物，為抗流感聯合用藥提供足夠的選擇空間。

根據治療慢性肝炎和艾滋病藥物的啟示[38]，以聚合酶為靶點的藥物，可以抑制病毒復制、轉錄，有效發揮抗病毒作用。RNA聚合酶PA亞基是流感病毒生命周期中關鍵蛋白，一方面其內切酶活性是病毒mRNA合成所必須的，并且在宿主細胞中不存在類似活性的酶；另一方面酶活性中心的關鍵氨基酸殘基在3型流感病毒中高度保守、突變率低，耐藥性出現的頻率低，這些特點都決定PA亞基可能成為抗流感新靶點。針對此靶點的抑制劑，不僅能夠有效抑制多種類型流感病毒轉錄過程，同時對宿主無毒，耐藥性出現慢，能夠成為高效、廣譜、低毒抗流感藥物。

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PA subunit of RNA polymerase：a potential drug target for anti-influenza

LIAN Wen-wen1, LIU Ai-lin1,2,3, DU Guan-hua1,2,3

(1.InstituteofMateriaMedica,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China;2.BeijingKeyLaboratoryofDrugTargetResearchandDrugScreening,Beijing100050,China;3.StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstanceandFunctionofNaturalMedicines,Beijing100050,China)

Influenza is a globally serious contanious desease. The main problems faced with anti-influenza agents are the drug resistance and low efficacy to highly pathogenic virus. RNA polymerase is acritical enzyme involved in replication and transcription of virus in the host cell, and the PA subunit, which provides primers for viral transcription via its endonuclease activity, is a promising anti-influenza target. This article mainly discusses the PA subunit, including its structures, functions, and progress in the development of anti-influenza agents, providing information for research on the PA subunit and anti-influenza agents targeting PA subunit.

infuenza virus; the amino terminal of PA subunit; the carboxyl terminal of PA subunit; endonuclease; metal binding site; high throughput screen model

時間：2015-3-3 11:08 網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150303.1108.001.html

2014-10-18,

2014-12-25

國家科技部“重大新藥創制”科技重大專項(No 2014ZX09507003-002，2012ZX 09301002-2013HXW-11)；國際合作項目(No 2011DF R31240)

連雯雯(1989-)，女，博士生，研究方向：抗流感藥物研究及新藥發現，Tel：010-83157220，E-mail：lianwenwen1989@imm.ac.cn; 劉艾林(1968-)，女，博士，博士生導師，研究方向：抗流感藥物研究、計算藥理學及新藥發現，Tel：010-83150885，E-mail：liuailin@imm.ac.cn; 杜冠華(1956-)，男，博士，博士生導師，研究方向：藥理學及新藥發現，Tel：010-63165184，E-mail：dugh@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.03.001

A

1001-1978(2015)03-0297-06

R-05；R345.57；R373.13；R977.3；R978.7