健康和病變關節軟骨的傅里葉變換紅外光譜顯微成像及Fisher判別

毛之華等

摘 要 傅里葉變換紅外光譜顯微成像（FTIRI）可同時獲得樣品的紅外光譜和形貌信息，其與化學計量學方法結合，可實現生物組織中主成分含量及分布的定量研究。本研究采用FTIRI技術結合主成分分析（PCA）以及Fisher判別算法對正常和病變的關節軟骨進行鑒別分析。對關節軟骨切片進行實現FTIR掃描及光譜分析，再利用SPSS軟件對軟骨的光譜（矩陣）進行主成分分析，根據主成分得分矩陣構造分類函數，結合Fisher判別算法對樣本進行分類識別。正常和病變的關節軟骨樣品識別準確率高達95.7%（初始案例）和94.3%（交互驗證案例）。本方法可準確有效地辨別關節軟骨是否發生病變，為監測骨關節炎的發生和修復提供參考。

關鍵詞 關節軟骨，傅里葉變換紅外光譜，主成分分析，Fisher判別

1 引 言

關節軟骨覆蓋骨關節表面，能有效減少關節間的摩擦、承受機械壓力和緩沖震動，在生命運動中發揮著重要作用[1]。關節軟骨由軟骨基質和軟骨細胞組成。軟骨基質的主要成分為II型膠原蛋白（Collagen）、蛋白多糖（PG，主要是硫酸軟骨素CS6）、水和少量的無機離子等[2]。膠原蛋白構成軟骨基質纖維網絡的基本架構，并有效固定蛋白多糖[3]。蛋白多糖則能保證關節軟骨的彈性和耐壓性[4]。軟骨基質外表面到潮線之間呈板層狀結構，由連續的3層構成：表層區（SZ）、過渡區（TZ）和深層區（DZ）[5]。在3個分區內，基質主成分的含量及空間分布各不相同[6]。

年齡增長、外傷、負重等因素都可能改變軟骨基質主成分的含量及空間分布，從而導致骨關節炎（OA）的發生[7，8]。OA早期主要表現為軟骨基質主成分濃度以及軟骨細胞形態和活性的改變，無明顯的組織損傷出現[9]。這對OA的早期診斷造成極大困難。目前關于關節軟骨的研究方法主要有：陽離子染色劑結合顯微分光光度測量法[10]、熒光探針結合競爭酶聯免疫吸附測定法[11]、生化分析法、磁共振成像（MRI）技術[12]等。但以上方法對于OA期間主成分微量變化的監測仍顯不足。

傅里葉紅外光譜顯微成像（FTIRI）可同時實現樣品的紅外光譜采集和紅外圖像掃描。其圖像的每個像素對應一個紅外光譜，利用偽彩色表示該像素處的平均吸收率。FTIR圖像形象直觀地描述樣品組分的結構及其特征基團的空間分布和含量變化[13～15]，將空間定位技術與定量分析能力有機結合，具有更高的空間分辨率、光譜分辨率及靈敏度。主成分分析（PCA）的宗旨是對復雜系統中的數據進行降維，將原變量轉換成少數幾個新變量，能夠從光譜數據中提取主成分的半定量信息， 使研究的問題簡單化，數據特征更明顯，同時排除噪聲影響。它可將光譜矩陣分解為主成分載荷和得分矩陣，其中得分矩陣表示主成分的相對濃度，而載荷矩陣表示主成分的歸一化光譜[16]。Fisher判別是一種借助方差分析建立判別函數，對數據集進行快速分類的分析方法。其基本過程是根據已知類別的數據組構造判別函數，判別系數的確定原則是類間的協方差最大且類內的協方差最小。利用判別函數計算待鑒別樣品的判別得分，通過與閾值比較，判別它的類屬。Fisher判別的優勢在于應用范圍廣泛，對各類分布及方差沒有限制，能較好地適應復雜對象的鑒別分析[16]。

紅外光譜技術結合PCA以及Fisher判別在生物醫學領域已有應用研究的報道[17，18]。目前， 該方法尚未應用于關節軟骨的相關研究中。本研究采用FTIRI結合PCA以及Fisher判別算法，對正常和病變的關節軟骨樣本進行鑒別分析。本方法為研究OA的發生和修復的實時監測提供參考。

2 實驗部分

2.1 實驗儀器

實驗所用成像儀器是 PerkinElmer Spotlight300 FTIRI System （Wellesley， MA）。系統主要分為兩部分：紅外顯微成像系統和傅里葉變換紅外光譜儀。成像系統的探頭由一個液氮冷卻的16陣元MCT（汞鎘碲化合物）焦平面陣列檢測器和一個單點MCT檢測器組成，可獲得樣本的紅外吸收圖像以及可見光圖像。傅里葉變換紅外光譜儀主要是由光源、邁克遜干涉儀、樣品室、檢測器和計算機組成。

2.3 光譜數據分析

PCA過程中，首先根據光譜矩陣計算協方差矩陣；接著計算矩陣的特征值和特征向量；然后根據特征值計算方差貢獻率；最后計算主成分得分矩陣，以便進一步的Fisher判別。為了盡量減少研究對象數據信息的損失，又能減少變量和簡化問題，選取累計方差貢獻率達85%以上的前幾個因子作為主成分。Fisher判別是通過對已知類屬的樣本變量進行變換（保證類內離散度盡可能小，類間離散度盡可能大）構建典型判別函數。根據判別函數計算樣本聚類中心的歐氏距離，得到分類函數。將未知類屬的樣本數據代入分類函數，并根據結果將其歸于歐氏距離最小的一類。PCA及Fisher判別采用SPSS 20軟件完成。

3.2 主成分分析

PCA所得前4個主成分的累計貢獻率如表1所示，前兩個主成分的累計貢獻率達到88.138%，能夠表示光譜數據矩陣的大部分特征。主成分因子數的大小會影響Fisher判別模型的訓練與預測結果，需要進一步優化以選擇最佳因子數，建立Fisher判別模型。在不同因子數條件下，初始案例和交互驗證案例的識別率不同。當主成分因子數為2時，初始案例的識別率達95.7%；交叉驗證案例的識別率達94.3%。隨著因子數的增加，樣本的正確識別率平緩上升；當因子數為8時，正確識別率穩定在100%。綜上，所提取的前兩個主成分能夠表示原光譜矩陣的大部分信息，極大地簡化所需分析的數據量， 并且使得Fisher判別模型有較高的識別率和判別效率。

根據案例編號可知，誤判案例多取自病變樣本的TZ（#42， 43， 46）。個別案例誤判的原因可能是：一方面，手術誘導后8周的病變樣本中組分含量變化在SZ較明顯，而在其它區域（如TZ）含量變化較小[23]；另一方面，誤判案例所在區域內的軟骨基質中有大小形態發生變化的軟骨細胞的分布，相對于軟骨基質，軟骨細胞對紅外光有較強的散射效應影響了模型對樣本的識別，這也可能導致該模型的錯誤識別。此外，在本實驗建模過程以及近期的一系列病變樣本的研究中發現，主成分因子為2的情況下，均會得到兩個二元一次函數，即分類函數。隨著訓練組數據量的變化，分類函數（公式（1）和（2）當中的得分系數也隨之發生變化，但總識別率都比較高（接近95%），且初始案例和交叉驗證的判別結果也十分接近，因此可以判斷本研究建立的判別模型有穩定的可靠性。

4 結 論

利用FTIRI技術對正常和病變關節軟骨樣本進行成像，提取紅外吸收光譜后，采用PCA對數據進行降維，再結合Fisher判別算法構建關節軟骨的判別模型，以完成對樣本的鑒別。結果表明，在主成分因子數為2的條件下，訓練組初始案例總識別率為95.7%，交互驗證案例總識別率為94.3%，預測組樣本全部正確識別。其中，正常樣本全部正確識別，只有個別病變樣本案例出現誤判。本方法能較為準確、可靠地對正常和病變的關節軟骨進行鑒別，并為早期OA的研究提供了一種潛在的簡便、快速、可靠的方法。

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