超高效液相色譜—譜聯用技術同時檢測大鼠血漿中蒿甲醚及其主要代謝產物雙氫青蒿素

李春等

摘 要 為了研究蒿甲醚在大鼠體內的藥代動力學行為，應用液液萃取超高效液相色譜單四極桿靜電場軌道阱串聯質譜技術，建立了高靈敏度的大鼠血漿中蒿甲醚及其主要代謝產物雙氫青蒿素的分析方法。以青蒿素為內標（Internal standard，I.S.），在正離子TargetedMS2檢測模式下對蒿甲醚和雙氫青蒿素進行定性和定量分析。檢測離子對分別為m/z 316.2115/163.1117（蒿甲醚）、m/z 302.1958/163.1117（雙氫青蒿素）和m/z 300.1803/209.1536（I.S.）；蒿甲醚和雙氫青蒿素在2～200 μg/L范圍內線性關系良好（R2>0.9990）；檢出限為0.8 μg/L；定量限為2.0 μg/L；加標回收率分別為93.7%～103.7%和97.4%～104.7%；相對標準偏差均小于9%。本方法快速靈敏，重現性好，可用于蒿甲醚體內藥代動力學研究。

關鍵詞 蒿甲醚； 雙氫青蒿素； 靜電場軌道阱； 大鼠血漿； 藥代動力學

1 引 言

瘧疾是由瘧原蟲引起的可由雌性按蚊傳染到人類的重大傳染病，多發于非洲、南美等熱帶欠發達地區，嚴重威脅著人類的健康。在全球范圍內，每年約五十億人感染瘧疾，其中一百多萬人死于瘧疾[1]。

蒿甲醚（Artemether，ARM）是天然產物青蒿素（Artemisinin，ART）的一種半合成衍生物，因具有比青蒿素更好的生物利用度而廣泛用于臨床瘧疾治療，蒿甲醚和青蒿素在體內代謝，迅速轉化為雙氫青蒿素（Dihydroartimisinin， DHA），DHA也具有抗瘧活性[2]。為了研究蒿甲醚在模型動物體內的藥代動力學，需要同時檢測模型動物血漿中蒿甲醚和雙氫青蒿素的濃度，建立特異性強、靈敏度高的分析方法。

目前，檢測蒿甲醚的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜質譜聯用法和液相色譜質譜聯用法。由于青蒿素衍生物分子中沒有共軛結構，紫外吸收不明顯，因此高效液相色譜法用紫外檢測器時需要繁雜的柱后衍生過程才能達到體內藥物含量檢測所需的靈敏度[3，4]。應用電化學檢測器可提高靈敏度，但是需要控制嚴格的厭氧環境，樣品和流動相也都需要脫氧[5，6]。氣相色譜質譜聯用法可獲得高效液相色譜法應用電化學檢測器時的檢測限，但是需要0.5～1.0 mL的血漿樣品[7，8]。液相色譜質譜聯用法因其特異性強、靈敏度高、樣品無需衍生化處理等優點，近年來被廣泛用于青蒿素衍生物的檢測。其中高效液相色譜三重四級桿串聯質譜技術應用最為廣泛[2，9～17]。

靜電場軌道阱是一種新興的一種質譜質量分析器，具有較高的分辨率和質量準確度[18]，具備一級和二級高分辨質譜掃描模式，適用于復雜基質中代謝物的定性與定量分析[19]。目前，應用高效HPLC四級桿靜電場軌道阱質譜聯用技術做定量分析的報道較少，針對蒿甲醚及其代謝產物測定尚未見報道。本研究建立了超高效液相色譜四級桿靜電場軌道阱質譜同時檢測蒿甲醚及其主要代謝產物雙氫青蒿素的方法。本方法簡單快速，特異性強，回收率高，重現性好，并用于蒿甲醚在大鼠體內的藥代動力學研究。

2 實驗部分

2.1 儀器、材料與試劑

Q Exactive四級桿靜電場軌道阱高分辨質譜系統、Dionex UltiMate 3000快速高效液相色譜系統、D11931超純水系統（美國Thermo Fisher公司）；3K15型高速離心機（德國 Sigma 公司）；MS3型渦旋混合器（德國 IKA 公司）；XA105電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；EWHL388型超低溫冰箱（中科美菱低溫科技有限責任公司）。

甲醇、乙腈和乙酸乙酯（色譜純，美國Sigma Aldrich公司）；乙酸銨（迪馬科技有限公司）蒿甲醚（ARM）、雙氫青蒿素（DHA）和青蒿素（ART）均購自于重慶華立武陵山制藥有限公司；清潔級Wistar 大鼠（雄性，體重約200 g）購自北京海淀興隆實驗動物有限公司。

2.2 樣品前處理

2.2.1 標準儲備液和標準工作液的配制 準確稱取ARM和DHA各5.00 mg，用甲醇分別定容至50 mL，配成100 mg/L的ARM儲備液和DHA儲備液，吸取ARM儲備液和DHA儲備液各1 mL，用甲醇定容至10 mL，得到ARM和DHA濃度均為10 mg/L的混合儲備液。將混合儲備液用甲醇逐級稀釋成ARM和DHA濃度各為2000， 1000， 500， 200， 100， 50 和20 μg/L的系列工作液。將工作液分別再用大鼠空白血漿稀釋10倍，即成ARM和DHA的濃度為200， 100， 50， 20， 10， 5和2 μg/L的標準工作液。將混合儲備液，用大鼠空白血漿逐級稀釋成180， 90和6 μg/L的標準質量控制工作液。

準確稱取ART 5.00 mg，用甲醇定容至50 mL，配成100 mg/L的內標儲備液，將此儲備液用甲醇稀釋為500 μg/L內標工作液。

4 結 論

本研究以超高效液相色譜四級桿靜電場軌道阱質譜串聯技術建立了大鼠血漿中ARM和DHA同時測定的分析方法，在TargetedMS2模式下，可以實現對ARM和DHA準確的定性和定量分析。本方法特異性強、靈敏度高、準確度好、需要樣品量少、單個樣品分析時間短，適用于生物基質中ARM及其代謝產物DHA的同時分析檢測，為蒿甲醚的藥代動力學研究提供技術參考。

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