糖蛋白糖基化位點(diǎn)及糖型的多重質(zhì)譜分析

于晶等

摘 要 以糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）為研究對象，采用基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜（MALDITOF/TOFMS）、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICRMS）的碰撞活化解離（CAD）和電子轉(zhuǎn)移解離（ECD）多種質(zhì)譜技術(shù)對RNase B的糖肽的完整信息進(jìn)行解析。通過多種質(zhì)譜相互驗(yàn)證，確定了RNase B的糖肽組分的氨基酸序列為SRNLTK、糖鏈結(jié)構(gòu)為（HexNAc）2（Hex）5（HexNAc）2（Hex）9及糖基化位點(diǎn)為第34位氨基酸殘基。本方法為糖蛋白結(jié)構(gòu)的全面解析提供了一種快速、有效、全面的研究思路。

關(guān)鍵詞 基質(zhì)輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜； 傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜； 碰撞活化解離； 電子捕獲解離； 核糖核酸酶B

1 引 言

蛋白質(zhì)的糖基化是糖鏈在糖基轉(zhuǎn)移酶作用下結(jié)合到蛋白質(zhì)特定氨基酸殘基上[1]，是蛋白質(zhì)的一種重要的翻譯后修飾方式[2]。目前， 已知哺乳動物蛋白質(zhì)中至少有1/2是糖蛋白，廣泛分布于各種組織和細(xì)胞中[3]。糖蛋白糖鏈的結(jié)構(gòu)多樣，功能復(fù)雜，并且由于生物合成的非模板性和結(jié)構(gòu)的微不均一性，使糖鏈具有了更多的分支結(jié)構(gòu)、連接方式和空間構(gòu)象，因此，修飾后的糖蛋白會產(chǎn)生多種生物活性，對生物體的生長、發(fā)育甚至對生物體的生存起著至關(guān)重要的作用[4]。蛋白質(zhì)的糖基化類型主要為N連接和O連接的糖基化，N連接的糖基化發(fā)生在特定的氨基酸序列AsnXSer/Thr，其中X是除脯氨酸以外的任意氨基酸。O連接的糖基化發(fā)生在Ser/Thr氨基酸序列上。蛋白質(zhì)糖基化與許多疾病的發(fā)展密切相關(guān)，在某些疾病狀態(tài)下，聚糖的相對豐度和分支結(jié)構(gòu)與正常相比發(fā)生了變化[5]，這些異常的變化可為疾病的早期診斷及治療提供幫助[6]。

常規(guī)的糖蛋白研究方法主要有基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDITOFMS）[7]、電噴霧質(zhì)譜（ESIMS）[8]、傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜（FTICRMS）[9]等。MALDITOFMS和ESIMS這兩種方法都是對糖鏈和肽段分別研究，以得到糖基化位點(diǎn)和糖鏈結(jié)構(gòu)信息，或者是在完整糖肽水平上對糖蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。但是在對完整糖肽進(jìn)行解析時，得到的主要是糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，糖肽序列信息較少，導(dǎo)致位點(diǎn)鑒定困難，尤其是對于未知的樣品。完整糖蛋白的全面解析對于疾病的診斷與治療、糖蛋白藥物的篩選及蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有重要意義。因此，開發(fā)完整糖肽水平的研究方法顯得尤為重要。FTICRMS的碰撞誘導(dǎo)解離（CAD）可以得到糖鏈的結(jié)構(gòu)信息，電子捕獲解離（ECD）碎裂方式通過捕獲一個自由電子，使其與質(zhì)子化的多電荷肽段相互作用，從而誘發(fā)多肽主鏈在NCα鍵處發(fā)生斷裂，主要產(chǎn)生C、Z離子，在碎片離子上保留修飾基團(tuán)為翻譯后修飾位點(diǎn)的鑒定提供了重要的信息[10，11]。MALDITOF/TOFMS樣品需求量少，且提供豐富的低分子段碎片離子信息。因此，采用多重質(zhì)譜的聯(lián)合分析為完整糖肽的全面研究提供可能。

本研究以糖蛋白核糖核酸酶B（RNase B）的完整糖肽為研究對象，采用液相色譜分離富集，聯(lián)合MALDITOF/TOFMS和FTICRMS的CAD和ECD解離模式等多種質(zhì)譜技術(shù)，在解析糖鏈結(jié)構(gòu)的同時，獲得肽段序列和糖基化位點(diǎn)的信息，實(shí)現(xiàn)糖蛋白結(jié)構(gòu)的全面、同步解析，為未知及復(fù)雜糖蛋白的完整糖肽的解析提供參考方法。

4 結(jié) 論

本研究采用液相色譜對樣品中的糖肽進(jìn)行分離富集，MALDITOF/TOFMS和FTICRMS多重質(zhì)譜檢測，對糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)及糖基化位點(diǎn)進(jìn)行同步解析。MALDITOF/TOFMS通過對少量樣品的完整糖肽及切除糖鏈的肽骨架分析，可獲得肽骨架序列、糖基化位點(diǎn)及糖鏈結(jié)構(gòu)的信息，分析速度快。FTICRMS的CAD碎裂模式和ECD碎裂模式相結(jié)合，不需要切除糖鏈即可實(shí)現(xiàn)肽段序列、糖基化位點(diǎn)及糖鏈結(jié)構(gòu)的同時分析，如與nanoLC聯(lián)用，可望進(jìn)行糖肽的定量分析。多種質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)合及相互驗(yàn)證，鑒定RNase B的糖鏈結(jié)構(gòu)為（HexNAc）2（Hex）5（HexNAc）2（Hex）9，糖基化位點(diǎn)為第34位氨基酸殘基，糖肽氨基酸序列為SRNLTK。本研究為復(fù)雜糖蛋白的結(jié)構(gòu)解析提供了一種簡單、有效的方法，對于蛋白質(zhì)組學(xué)研究特別是蛋白質(zhì)翻譯后修飾研究具有重要的意義，同時也為糖蛋白藥物的篩選及疾病的診斷與治療提供幫助。

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