殼聚糖絮凝法精制川牛膝總多糖酶提取液的工藝研究

成 悅 劉傲霞 夏玉婷 谷旭晗 韓 偉

（華東理工大學中藥現代化工程中心，上海200237）

殼聚糖絮凝法精制川牛膝總多糖酶提取液的工藝研究

成 悅 劉傲霞 夏玉婷 谷旭晗 韓 偉

（華東理工大學中藥現代化工程中心，上海200237）

以殼聚糖為絮凝劑對川牛膝的總多糖進行了絮凝純化研究。通過單因素考察及正交試驗得到優化的工藝條件為：絮凝溫度45℃、殼聚糖用量0.4 mL/g生藥量、絮凝時間2 h、藥液濃縮比1∶12、藥液pH＝4。此時，多糖保留率76.32%、脫蛋白率64.25%，與傳統醇沉工藝相比，絮凝法得到的多糖保留率和純度較高。

殼聚糖；絮凝；川牛膝；總多糖；試劑

0 引言

川牛膝為莧科植物川牛膝（Cyathula officinaIis Kuan）的干燥根，為著名川產藥材，具有補肝腎、強筋骨、治療腰膝酸麻及肝陽眩暈、散癖血、消腫痛等功效。川牛膝多糖是從川牛膝根中提取的一種生物活性多糖，相對分子質量1 000～2 200，是高度分支的果聚糖。現代藥理研究表明，川牛膝多糖具有促進紅細胞免疫、抗腫瘤、對抗環磷酰胺所致外周白細胞減少等療效。

絮凝技術是一種簡單有效的固液兩相體系分離方法，殼聚糖作為一種天然的鏈狀高分子絮凝劑，由葡萄糖胺通過β-1，4-糖苷鍵連接而成。由于分子中含有氨基，使殼聚糖在酸性條件下帶有正電荷，可發揮電中和與吸附架橋的雙重絮凝作用，并具有安全、無毒、穩定的優點。

本文以多糖保留率和脫蛋白率為指標，考察殼聚糖對川牛膝總多糖酶提取液的絮凝純化工藝，并通過數據分析優化工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

1.1.1 藥材

川牛膝，產地為四川，購于上海雷允上藥店。將川牛膝粉碎過篩成干粉后進行預處理：用10倍量的體積分數95%的工業乙醇回流1 h，冷卻至室溫，取上清液回收乙醇，烘干藥渣，裝袋于陰涼處儲存備用。

1.1.2 主要試劑

纖維素酶，上海楷洋生物技術有限公司；95%工業乙醇；36%濃鹽酸、氫氧化鈉、5%苯酚溶液、98%濃硫酸等均為國產分析純；葡萄糖為標準品（＞95%），上海凌峰化學試劑有限公司；牛血清白蛋白和考馬斯亮藍G-250均為分析純，上海源聚生物科技有限公司；殼聚糖，上海偉康生物制品有限公司。

1.1.3 主要儀器

UV1900PC紫外可見分光光度計，上海亞研電子科技有限公司；pHS-2C數字式pH計，上海雷磁儀器廠；AL204分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；SHB-Ⅲ型循環水真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市英峪予華儀器廠；RE-52C旋轉蒸發器，上海予華儀器有限公司；RJ-TGL-16C臺式高速離心機，無錫市瑞江分機儀器有限公司。

1.2 樣品及試劑的制備

1.2.1 樣品溶液的制備

（1）藥材的預處理：將川牛膝粉碎過篩成干粉后進行預處理，用10倍量的體積分數95%的工業乙醇回流1 h，冷卻至室溫，回收乙醇，烘干藥渣，裝袋于陰涼處儲存備用。

（2）樣品溶液的制備：稱取20 g已處理的藥材和60 mg纖維素酶，置于500 mL的圓底燒瓶中；加入400 mL pH＝5的去離子水，在45℃恒溫水浴鍋中酶解提取30 min，再用電熱套冷凝回流30 min，室溫冷卻15 min后，放入冷水中冷卻（敞口）；冷卻至室溫后抽濾，收集濾液并量取其體積。

1.2.2 試劑的制備

（1）葡萄糖標準溶液的制備：精確稱取105℃干燥至恒質量的葡萄糖50 mg，加去離子水溶解并定容至500 mL，即得0.10 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

（2）質量分數5%苯酚溶液的制備：稱取精制苯酚2.50 g，加去離子水溶液并定容至50 mL棕色容量瓶，配制成質量分數5%的苯酚溶液。

（3）蛋白質標準溶液的制備：準確稱取20 mg結晶牛血清白蛋白，加水溶解，轉移至100 mL容量瓶中，定容，配制成0.20 mg/mL的蛋白質標準溶液。

（4）考馬斯亮藍G-250試劑的制備：準確稱取50 mg的考馬斯亮藍G-250，將其溶解于25 mL 95%的乙醇，再加入50mL85%的磷酸，加水定容至500mL。

（5）殼聚糖絮凝劑的制備：取10 g醋酸（ρ=1.050，約為9.5 mL）置于600 mL大燒杯中，加入適量去離子水稀釋；準確稱取10.0 g殼聚糖，分批多次加入大燒杯中，攪拌至完全溶解，轉移至1 000 mL容量瓶，補充去離子水定容，即配制成1%的殼聚糖醋酸溶液，將其放置于冰箱內2～3天充分溶脹后備用。

1.3 分析方法的建立及計算

1.3.1 川牛膝總多糖含量的測定

精密吸取葡萄糖標準溶液0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL，分別置于25 mL具塞比色管中，補充去離子水至2.0 mL。加入質量分數5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入質量分數98%的H2SO45.0 mL，搖勻，室溫靜置30 min。用紫外可見分光光度計分別在489 nm波長處測定其吸光度。以吸光度A為縱坐標、葡萄糖濃度C（mg/mL）為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A＝12.040 48C－0.024 32，相關系數R＝0.999 22。

準確移取2 mL樣品溶液，按相同的顯色操作，測定吸光度，根據回歸方程計算樣品溶液中總多糖的濃度及多糖保留率。

1.3.2 蛋白質含量的測定

分別稱取0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL的蛋白質標準溶液置于25 mL具塞比色管中，均補充去離子水至1.0 mL，各加入考馬斯亮藍試劑5.0 mL，立即搖勻，室溫下靜置5 min，以1 mL去離子水作空白對照，于595 nm處測定吸光度，以吸光度A為縱坐標、標準品濃度C（mg/mL）為橫坐標，繪制蛋白質標準曲線，得回歸方程為：A＝5.680 8C－0.058 7，相關系數R=0.999 32。

取樣品溶液1.0 mL，按相同的顯色操作，測定吸光度，根據回歸方程計算樣品中的蛋白質的含量及脫蛋白率。

1.4 實驗方法

移取一定濃縮比的藥液20 mL，在電磁攪拌狀態下，緩慢加入一定量的殼聚糖1%的醋酸溶液，水浴保溫攪拌一定時間后取出，離心分離，取上清液測定多糖和蛋白質的含量。

2 結果與分析

2.1 絮凝時間對絮凝純化結果的影響

圖1為絮凝時間對絮凝純化結果的影響。可以看出，多糖保留率隨時間的增加而降低，在1.5～2 h范圍內下降迅速，超過2 h后趨于穩定；而脫蛋白率隨著時間的增加逐漸增大，并趨于穩定，但絮凝時間過長對提高絮凝效果的作用不大，且多糖的損失會增加。

圖1 絮凝時間對絮凝純化結果的影響

綜上，絮凝時間選取1.5 h為宜。

2.2 濃縮比對絮凝純化結果的影響

藥液濃縮比對絮凝純化結果的影響如圖2所示，可以看出，多糖保留率和脫蛋白率均隨著濃縮比的增大而增大，在稀釋到1∶10（g/mL）后，兩者均有下降趨勢，且脫蛋白率的下降趨勢更為明顯。

圖2 藥液濃縮比對絮凝純化結果的影響

產生這一現象的原因是，當濃縮比合適時，藥液能與絮凝劑充分結合，在分子間架橋并發揮絮凝作用。藥液濃度過小，溶液黏度較大，膠粒間距較小，不利于殼聚糖高分子鏈的分散，多糖易被包裹沉淀，造成多糖損失較大；藥液濃度過大，殼聚糖濃度降低，不利于絮凝劑分子與雜質微粒的充分接觸，導致脫蛋白率降低。

綜上，濃縮比選取1∶10為宜。

2.3 溫度對絮凝純化結果的影響

圖3為絮凝溫度對純化結果的影響。可以發現，隨著絮凝溫度的增加，多糖保留率逐漸下降，而脫蛋白率先上升后下降，在溫度為45℃時，脫蛋白率達到最高。這是因為溫度升高，分子熱運動較快，絮凝劑與雜質分子的碰撞幾率增大，溶液在高溫下黏度加大，膠體顆粒結合成的絮凝體也增大，因此加速了絮凝。但溫度過高，易使絮凝劑分子老化，阻礙絮凝。

圖3 絮凝溫度對絮凝純化結果的影響

綜上，確定絮凝溫度在45℃左右為宜。

2.4 殼聚糖用量對絮凝純化結果的影響

殼聚糖用量對絮凝純化結果的影響如圖4所示。隨著殼聚糖用量的增加，脫蛋白率增加，在0.8 mL/g后增加趨勢減緩，多糖保留率逐漸下降。這是因為殼聚糖濃度較低時，絮凝劑分子與雜質微粒的碰撞幾率小，進行電中和與吸附架橋的作用弱，不利于絮凝作用的發揮；隨著殼聚糖用量增加，碰撞幾率增大，除雜效果提升，但不利于架橋作用，使多糖保留率降低。

圖4 殼聚糖用量對絮凝純化結果的影響

綜上，殼聚糖用量選取0.4 mL/g為宜。

2.5 溶液pH對絮凝純化結果的影響

圖5為pH值對絮凝純化結果的影響。可以看出，隨著藥液pH的升高，多糖保留率迅速下降，在pH為6之后趨于平穩，而脫蛋白率先迅速上升，后逐漸下降，在pH為4時脫蛋白率最高。產生這一現象的原因是，殼聚糖具有電中和與吸附交聯作用，當pH較低時，蛋白質為陽離子型，使殼聚糖電中和效果降低，脫蛋白率下降，同時多糖損失較多。當溶液pH較高時，體系中的負電荷增加，殼聚糖電中和負電荷增加，壓縮雙電層的效率降低，導致蛋白質去除率也下降。

圖5 溶液pH值對絮凝純化結果的影響

綜上，選取溶液pH＝4為宜。

3 殼聚糖絮凝純化正交試驗

3.1 因素與水平的確定

根據單因素實驗結果，選取對川牛膝多糖保留率及脫蛋白率影響較大的因素：殼聚糖用量（因素A）、濃縮比（因素B）、藥液pH（因素C）、絮凝時間（因素D），設計L9（34）正交試驗表，結果如表1所示。

表1 殼聚糖絮凝純化L9（34）因素水平表

3.2 正交試驗結果分析

現以多糖保留率、脫蛋白率為評價指標，根據L9（34）正交設計開展試驗，實驗結果與極差分析如表2所示，多糖保留率與脫蛋白率的方差分析分別如表3、表4所示。

由表2可知：

（1）以多糖保留率為評價指標，各因素對殼聚糖絮凝純化工藝的影響大小依次為：A＞B＞D＞C，最佳工藝條為A1B3C1D2；表3的方差分析結果表明：殼聚糖用量、濃縮比、絮凝時間對多糖保留率均有顯著影響。

（2）以脫蛋白率為評價指標，各因素對殼聚糖絮凝純化工藝的影響大小依次為：A＞C＞D＞B，最佳工藝條件為A2B3C3D3；表4的方差分析結果表明：殼聚糖用量、藥液pH、絮凝時間對脫蛋白率的影響顯著。

綜合上述分析結果，本研究主要根據脫蛋白率指標優選工藝條件，得到最佳工藝條件A2B3C3D3：殼聚糖用量0.4 mL/g生藥量、濃縮比為1∶12、藥液pH＝5、絮凝時間為120 min，此時多糖保留率為76.32%、脫蛋白率為64.25%。

表2 殼聚糖絮凝純化實驗結果與極差分析表

表4 脫蛋白率方差分析表

4 結語

（1）以多糖保留率和脫蛋白率為指標，在單因素實驗的基礎上，選擇濃縮比、絮凝時間、殼聚糖用量、藥液pH這4個因素進行L9（34）正交設計實驗，確定最優的工藝條件為：殼聚糖用量0.4 mL/g生藥量、濃縮比為1∶12、溶劑pH＝5、絮凝時間為120 min，此時，多糖保留率為76.32%，脫蛋白率為64.25%。

（2）利用統計學方法對正交實驗結果進行顯著性檢驗，確定各因素對多糖保留率影響大小的順序為：殼聚糖用量＞濃縮比＞藥液pH＞絮凝時間，其中殼聚糖用量、濃縮比、絮凝時間都為顯著影響因素；確定各因素對脫蛋白率影響大小的順序為：殼聚糖用量＞藥液pH＞絮凝時間＞濃縮比，其中殼聚糖用量、藥液pH、絮凝時間都為顯著影響因素。

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Study on the Flocculating Purification Process of Total Polysaccharides from Cyathula Officinalis Kuan by Using Chitosan

Cheng Yue Liu Aoxia Xia Yuting Gu Xuhan Han Wei
（Engineering Center for Tradition Chinese Medicine Modernization,East China University of Science and Technology, Shanghai 200237）

The essay was aimed at studying flocculating purification of total polysaccharides by using chitosan. The optimum conditions were obtained through single factor and orthogonal experiment.The results were as follows∶the temperature was 45℃,dosage of chitosan was 0.4 mL/g raw material,flocculation time was 2 h,solution concentration ratio was 1∶12,pH of solution was 4.Under this condition,polysaccharides retention rate was 76.32%, deproteinizing rate of 64.25%.Compared with the traditional alcohol precipitation process,the retention rate and purity of the polysaccharide of the flocculation purification process are higher.

chitosan;flocculate;Cyathula officinalis Kuan;total polysaccharide;reagent

2015-07-15

成悅（1992—），女，寧夏銀川人，助理工程師，研究方向：制藥工程與技術。

韓偉（1968—），男，江蘇揚州人，博士，教授，從事中藥制藥工程、化工分離工程的研究工作。

國家大學生創新創業訓練計劃，項目編號：131025159；華東理工大學本科教育教學改革項目（2013年）