解偶聯蛋白2在PM2.5所致的氧化應激損傷心肌細胞中的作用機制探討*

鄭貴浪 吳家興

近年來，環境污染問題備受關注，尤其是大氣污染。其中顆粒物是城市大氣污染的重要物質，其管徑大小不一，危害有別。其中，空氣動力學直徑<2.5 μm的顆粒物被稱為細顆粒物（PM2.5），與人體健康關系最為密切。流行病學調查研究提示，PM2.5對人體的損害很大，尤其是呼吸系統。近年來，其與心血管疾病關系的研究較多。越來越多的學者認為，PM2.5不但可增加冠心病、高血壓、糖尿病患者的心血管疾病的發病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病的發病率和死亡率，甚至誘發心律失常、心肌缺血乃至心跳聚停等嚴重情況發生[1-4]。筆者前期研究也發現，PM2.5可以導致H9C2心肌細胞線粒體損傷，從而引起活性氧（Reactive oxygen species， ROS）產生增多，ATP合成不足，線粒體膜電位損害，PM2.5導致的心肌細胞損傷與線粒體氧化應激過強有關[5]。

線粒體是體內ROS產生的主要部位，而解偶聯蛋白（Uncoupling proteins，UCPs）是線粒體內膜上能夠通過轉運H+降低線粒體膜電位蛋白家族，與細胞內的ROS有著密切的關系[6-7]。線粒體膜電位的輕微改變可以影響ROS的含量。因此，UCPs與ROS的產生關系密切。在5種UCPs的同類物中，UCP2分布最廣泛。在糖尿病及神經細胞的保護研究中發現，UCP2可以減少ROS的產生從而起到保護作用，其機制與其通過解偶聯作用進而降低線粒體的膜電位有關[8-9]。筆者的前期研究也發現，通過RNA干擾沉默UCP2后，細胞內ROS產生明顯增高，提示UCP2的保護作用。

氧化應激過度增強是心肌細胞線粒體功能損傷的重要因素。ROS產生過多，保護因素減弱，如還原型谷胱甘肽（GSH）減少，超氧化物歧化酶（SOD）減少，丙二醛（MDA）增多，在心肌細胞損傷中作用甚大。然而UCP2對PM2.5導致的氧化應激中作用如何，及其對GSH、SOD和MDA影響如何，目前研究較少。本研究就在前期研究的基礎上，將進一步揭示UCP2在PM2.5致氧化應激損傷心肌過程中的作用機制。

1 資料與方法

1.1 RNA干擾片段 由上海吉凱基因公司合成2條RNA干擾片段和1條陰性對照RNA干擾片段，進行RNA干擾片段的篩選。轉染成功后，進行RTPCR和Western Blot檢測UCP2基因在轉錄水平及蛋白水平表達情況。最后篩選出有效的干擾片段，即：siRNA2序列上游，5′-CCU CAU GAC AGA CGA CCU C dTdT-3′；下游，5′-GAG GUC GUC UGU CAU GAG G dTdT-3′。具體篩選步驟見前期研究（中國醫藥科學，2015年第3期）。

1.2 PM2.5配制及心肌細胞處理 H9C2細胞株購自中國科學院典型培養物保存委員會細胞庫，用10%小牛血清培養液，在37 ℃培養箱靜置培養；1~3 d更換一次培養液。當細胞生長至70%左右密度時，將細胞隨機分成三組，分別為NC組，PM2.5組及PM2.5+siRNA組，每組3個樣本。三組細胞分別給予常規的培養基，50 μg/mL的PM2.5培養基，含PM2.5（50 μg/mL）與siRNA（80 nmol/L）的培養基刺激。48 h后檢測相關指標。用PM2.5采樣儀采集PM2.5，超聲震蕩，洗脫顆粒物，冷凍真空干燥成干粉，-20 ℃保存備用。具體實驗步驟見前期研究[5]。

1.3 ROS的檢測 按照活性氧檢測試劑盒進行操作，購自碧云天，貨號S0033。簡要步驟為：各組細胞經過處理后，按照試劑說明用1∶1000無血清培養液稀釋DCFH-DA。去除細胞培養液，加入適當體積稀釋好的DCFH-DA。37 ℃細胞培養箱內孵育20 min，然后用無血清細胞培養液洗滌細胞三次。用熒光分光光度計檢測，激發波長488 nm和發射波長535 nm[10]。

1.4 GSH、總SOD及MDA的檢測 GSH比色法測定原理：二硫代二咲-硝基苯甲酸與巰基化合物反應時能產生一種黃色化合物，故可進行比色定量測定。采用谷胱甘肽測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，貨號為A006。SOD可清除超氧陰離子，從而抑制甲贊的形成，反應液藍色越深，說明SOD酶的活性愈低，反之則酶活性愈高。總SOD的檢測采用總SOD活性檢測試劑盒（NBT法），購自碧云天，產品編號為S0107。過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸（TBA）縮合，形成紅色產物，在532 nm處有最大吸收峰，故可用分光光度計對其進行量化。MDA的檢測采用丙二醛測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所，貨號為A003-1。GSH、總SOD及MDA的檢測均嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 統計學處理 采用SPSS 18.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以（s）表示，方差齊時，采用單因素方差分析進行統計，兩組間比較采用LSD法分析，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌細胞ROS和MDA的比較PM2.5+siRNA組心肌細胞內ROS含量明顯高于PM2.5組，PM2.5組的ROS明顯高于NC組，三組兩兩之間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。而MDA在PM2.5+siRNA組最高，PM2.5組其次，NC組最低，三組見兩兩比較有統計學意義（P<0.05），見表1。

表1 各組心肌細胞ROS和MDA含量比較（s）

表1 各組心肌細胞ROS和MDA含量比較（s）

NC 組 28.8±4.9 39.02±1.55 PM2.5 組 69.2±6.3 68.33±1.96 PM2.5+siRNA組 90.2±6.2 88.44±1.27 F值 86 707 P值 <0.05 <0.05

2.2 各組心肌細胞GSH含量及總SOD活性的比較PM2.5+siRNA組、PM2.5組和NC組三組之間的GSH含量和總SOD活性比較差異均有統計學意義（P<0.05）；兩指標均在PM2.5+siRNA組最低，在NC組最高，PM2.5組位于中間，且兩兩比較差異均有統計學意義（P<0.05），見表 2。

表2 各組心肌細胞GSH含量和總SOD活性比較（s）

表2 各組心肌細胞GSH含量和總SOD活性比較（s）

組別 GSH含量（mg/gprot）總SOD活性（U/mgprot）NC組 767.37±11.03 78.67±3.01 PM2.5組 533.05±10.83 50.37±1.98 PM2.5+siRNA組 421.17±16.90 30.09±2.02 F值 535 313 P值 <0.05 <0.05

3 討論

PM2.5作為大氣污染的重要物質，可作為載體吸附有毒重金屬、酸性氧化物、有機污染物、細菌和病毒等多種組分，嚴重危害人體健康。PM2.5可以損害人類的呼吸系統及心血管系統，很多研究均發現其是心血管疾病的促進因素之一[11-12]。深入研究PM2.5導致心肌細胞損傷的機制，為臨床治療PM2.5所致的遠期心肌損傷提供基礎研究支持，具有重要意義。

解偶聯蛋白（UCPs）是線粒體上的質子轉運蛋白，屬于線粒體陰離子通道家族。UCPs基因有高度的保守性，有6個家族成員，在人僅表達UCP1-5。UCP2蛋白廣泛表達于心肌、肝臟、胰腺以及腦組織等，現在多數認為其是保護性因素，特別是對胰島細胞及神經細胞的保護作用研究較多。筆者前期研究發現，PM2.5可以導致心肌細胞明顯損壞，導致肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）升高，損害線粒體的超微結構，導致線粒體腫脹，嵴斷裂，從而導致線粒體膜電位的改變[5]。通過RNA干擾技術沉默UCP2基因的表達后，心肌細胞的線粒體產生更多的ROS，并導致ATP含量的顯著下降，進一步加重了心肌細胞的損害。這提示，UCP2在PM2.5致線粒體的損傷中起著保護性的作用。

活性氧（ROS）是指具有氧化還原潛能的氧衍生物，包括游離的基團如：超氧陰離子、羥自由基、次氯酸鹽、過氧亞硝酸鹽和穩定的基團如過氧化氫。各種細胞均能產生ROS，其來源包括NAD（P）H氧化酶、線粒體、黃嗓吟氧化酶和環氧合酶等。生理狀態下，線粒體產生少量的ROS，對細胞有利；在某些病理條件下，線粒體產生大量的ROS，導致細胞器、DNA以及膜結構等損壞，甚至導致細胞凋亡、壞死[13]。GSH和SOD是清除機體過多ROS的重要防御系統。超氧化物通常在SOD的作用下，轉化為過氧化氫。GSH與過氧化氫結合，后者則轉化成水，減弱ROS的損害作用。MDA是脂質過氧化產物，其含量的改變可以間接反映ROS對脂質的損害作用，受到學者的廣泛應用。本研究發現，PM2.5可以導致心肌細胞氧化應激增強，ROS產生過多，從而導致脂質過氧化加劇，表現為MDA的含量明顯升高；此外ROS的過度增多，消耗了過多的GSH，導致GSH含量明顯下降；同時也消耗了大量的SOD，減弱了SOD的活性，導致心肌細胞抗氧化作用體系減弱。這與其他學者的發現是相一致的[14-15]。

通過RNA干擾技術，沉默心肌細胞UCP2的表達，筆者發現，PM2.5導致的心肌細胞氧化應激損傷進一步加劇，表現為：ROS含量進一步堆積，MDA含量進一步升高，從而過度消耗了機體的抗氧化酶，導致GSH含量明顯降低以及SOD活性明顯下降。而筆者在前期實驗發現，PM2.5可以導致線粒體損傷，而沉默UCP2可以加重線粒體損傷[5]。人為地抑制UCP2的保護作用，將導致細胞損傷的進一步加劇。這也間接地證明：UCP2在PM2.5導致的心肌細胞損傷中起著保護性的作用。這可能是UCP2通過調控線粒體膜電位，進而影響氧化應激的機制所介導的。目前，PM2.5對線粒體的影響，國內外也有少量研究[16-18]。然而本實驗也存在明顯的不足：（1）僅采用基因沉默的方法，沒有采用基因過表達方法探討UCP2對氧化應激的作用；（2）在指標檢測方面，沒有觀察線粒體的形態，檢測線粒體的膜電位及線粒體生物修復功能。

綜上所述，PM2.5可以導致氧化應激增強進而損害H9C2心肌細胞；RNA干擾UCP2基因的表達后，可導致心肌細胞的氧化應激損傷進一步加重。這提示，UCP2在PM2.5導致的氧化應激損傷過程中可能起著保護性作用。

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