反相高效液相色譜法測定不同方法炮制關木通中馬兜鈴酸的含量

李天鳳 李連坤 張美玲 貢濟宇 蔡廣知 趙躍剛

長春中醫藥大學，吉林長春 130117

關木通，別名木通馬兜鈴、東北木通、馬木通、萬年藤，為馬兜鈴科植物。東北馬兜鈴Aristolochia manshuriensis Kom.的干燥藤莖可入藥，古書記載有通經下乳、利小便、通心火等功效，為臨床常用藥物。

2000年以來，國內外發生多起由于服用馬兜鈴屬植物的藥物引起腎臟毒害事件。經學者研究證實，引起此類事件的是化合物馬兜鈴酸。目前該類藥材已被很多國家禁止應用，關木通也已被 《中國藥典》（2005年版）取消用藥標準。但這種做法并不可取，幾乎所有的藥物都有損害機體的潛力。有效成分如在正常范圍內則具有治療作用，但若超出正常范圍，就會變成有毒物質。怎樣利用中醫特色的炮制方法，將關木通中馬兜鈴酸的含量降低到0.002%成為問題的關鍵。若解決此問題將會為其他含有馬兜鈴酸中草藥的解毒開辟新道路，為臨床的安全用藥提供科學依據。

本研究用蜜炙、炒炙、姜炙等10種炮制方法處理關木通，采用反相高效液相色譜法對原生藥及炮制品中的馬兜鈴酸進行測定，計算馬兜鈴酸的脫除率。關木通中馬兜鈴酸的限量應不高于 《中國藥典》（2010年版）細辛中馬兜鈴酸的限量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

采用四元泵、自動進樣器和紫外二極管陣列檢測器、Agilent 1260高效液相色譜儀、Chemstation工作站來處理數據。其他儀器：藥材粉碎機（廣州興榮機械生產）、TDZ6B-WS型離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）、加壓溶劑提取儀（北京吉天儀器有限公司）、潔康PS-D30A型超聲儀。由氮氣供壓。

1.2 藥品

馬兜鈴酸對照品購自中國食品藥品檢定研究院，含馬兜鈴酸A 99.4%；色譜純甲醇、乙腈、冰醋酸、醋酸乙酯等購自Merck公司；純水（實驗用超純水機獲得）。

1.3 材料

1.3.1 材料來源

關木通購自上海市藥材有限公司，經長春中醫藥大學藥學院副院長貢濟宇教授鑒定，此品為東北馬兜鈴的干燥藤莖，為真品。所涉及的炮制品均由同源生品制得。姜、蜜、醋、酒為市售產品。

1.3.2 關木通藥材的炮制

1.3.2.1 炒焦制品的制法 用分析天平稱取關木通藥材30 g，置干凈的炒鍋內，使用文火炒至可以嗅到焦香味即可，倒出，冷卻干燥，稱重。將得到的炒焦制品密封保存，待用。

1.3.2.2 醋炙品制法 稱取關木通藥材30 g，精密量取25 mL陳醋噴灑于藥材表面[1]，待藥材將醋汁吸收完全后，置炒鍋內文火炒至嗅得藥材香味即可，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得醋炙品。密封保存，待用。

1.3.2.3 酒炙品制法 稱取關木通藥材30 g，量取黃酒20 mL噴灑于藥材表面，待藥材完全吸收后，文火炒至出現微黃色，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得酒炙品[2]。密封保存，待用。

1.3.2.4 蜜炙品制法 稱取關木通藥材30 g，加煉蜜10 g，文火炒至藥材將煉蜜全部吸收，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得蜜炙品。密封保存，待用。

1.3.2.5 姜炙品制法 使用分析天平精密稱取關木通藥材30 g，將20 mL姜汁均勻噴灑于藥材上（生姜榨汁），文火炒至藥材將姜汁全部吸收[3]，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得姜炙品。密封保存，待用。

1.3.2.6 堿制品制法 稱取關木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，12 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色，25℃恒溫干燥[4]，冷卻，稱重，即得堿制品。密封保存，待用。

1.3.2.7 甘草炙品制法 稱取關木通藥材30 g，加甘草汁20 mL（取甘草20 g用8倍量水煎煮，濃縮甘草汁至40 mL），文火炒至藥材將甘草汁全部吸收[5]，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得甘草炙品。密封保存，待用。

1.3.2.8 堿蜜合制品制法 稱取關木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，6 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色。25℃恒溫干燥，再加煉蜜10 g[6]，文火炒至藥材將煉蜜全部吸收，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得堿蜜制品。密封保存，待用。

1.3.2.9 堿姜合制品制法 稱取關木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，6 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色。25℃恒溫干燥，姜汁20 mL（取新鮮生姜，榨汁機榨汁），文火炒至藥材將姜汁全部吸收 ，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得堿姜制品。密封保存，待用。

1.3.2.10 堿酒合制品制法 稱取關木通藥材30 g，用0.1 mol/L NaHCO310倍體積浸泡3次，6 h/次。浸泡后用水洗至濾液無色。25℃恒溫干燥，量取黃酒20 mL噴灑于藥材表面[8]，待藥材吸收完全后，文火炒至出現微黃色，倒出，冷卻，干燥，稱重，即得堿酒制品。密封保存，待用。

2 方法與結果

2.1 反相高效液相色譜法測定馬兜鈴酸的含量

2.1.1 色譜條件

流動相：甲醇-1%冰醋酸進行梯度洗脫。1%冰醋酸在15 min內由50%降至5%，檢測波長為315 nm，流速為1 mL/min，柱溫為30℃[9]。在此條件下，各組分的分離度較好。馬兜鈴酸A的保留時間為13.999 min。

2.1.2 對照樣品的制備

精密稱取，取馬兜鈴酸A對照品1 mg，精密稱定，加甲醇用定容至50 mL，使用時稀釋，制成每毫升含0.2μg的溶液，即得。

2.1.3 標準曲線制備

分別精密吸取“2.1.2”項下馬兜鈴酸A對照品溶液 5、7、9、12、15 μL[10]，注入液相色譜儀，以進樣量（μg）為橫坐標，峰面積積分值為縱坐標。得到回歸方程：y=1.6×105x+21.463，R2=0.9990，馬兜鈴酸 A 線性范圍為0.0010~0.0030 μg。

2.1.4 關木通不同炮制品中馬兜鈴酸A的含量測定

將“1.3.2”項中關木通各種炮制品和購買的生品粉末分別過四號篩，分別精密稱取1 g，置于25 mL的容量瓶中。制成溶液，超聲，過濾。在波長315 nm處進行梯度洗脫，流動相是甲醇和1%冰醋酸。冰醋酸的比例在15 min內由50%降至5%。將測得的峰面積值代入“2.1.3”項的回歸方程中，計算馬兜鈴酸的濃度值，進而計算其含量。由表1可知，醋炙和堿制的關木通藥材中馬兜鈴酸的含量較低，并在合格范圍內，所以初步確定醋炙和堿制效果較佳。

表1 不同方法炮制的關木通中馬兜鈴酸含量測定結果

2.2 浸出物含量測定

2.2.1 供試品溶液的制備

精密稱取藥材粉末1 g，置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇-1%甲酸水溶液約15 mL，兩者比例為4∶1。浸泡1 h后，超聲提取3次[11]，15 min/次。定容至25 mL，過微孔濾膜，收集續濾液，注入1 mL進樣瓶中，即得，待用。

2.2.2 水浸出物的測定

使用分析天平精密稱取供試品4 g，溶解于250 mL錐形瓶中，加入適量的水（50～100 mL）。密塞，精密稱定重量并記錄。靜置冷卻至室溫后，連接回流裝置，并保持微沸1 h。放冷，將錐形瓶取下，密塞，稱量[12]，減失的重量須用蒸餾水補足，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置于已干燥至恒重的蒸發皿中，水浴揮干，于105℃干燥箱中干燥3 h[13]，再于干燥器中冷卻30 min，迅速稱重，記錄數據。除非另有規定，供試品中水溶性浸出物的百分含量[14]以干燥品來計算。

2.2.3 乙醇浸出物的測定

按“2.2.2”項中水溶性浸出物測定法完成關木通藥材中乙醇浸出物的測定。各個操作項下的溶劑用規定濃度的乙醇替代水。由表2可知，醋炙品水浸出物與醇浸出物的含量相當，相對于其他方法比較穩定，可認為醋炙為最佳方法。

表2 浸出物含量的測定結果（mg）

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度的考察

精密量取“2.1.2”項下的對照品溶液，分別平行進樣6次，每次的進樣量為10μL[15]并記錄峰面積。峰面積的平均值為1 257 231，計算得RSD=1.726%（＜2%），符合規定。結果表明儀器精密度良好，結果準確可信。

2.3.2 重復性的考察

取“1.3.2”項下姜炙關木通粉末，過三號篩[16]，電子分析天平精密稱取5份，分別依“2.2.1”項下的供試品溶液制備方法進行制備。測定含量，記錄峰面積，計算得峰面積的平均值為3 917 288，進而計算出峰面積的RSD=0.2687%（＜2%），說明儀器重現性良好，結果準確可靠，可以用于含量測定。

2.3.3 穩定性的考察

使用分析天平量取“1.3.2”項下的堿制關木通粉末，過三號篩，精密稱取1份，依“2.2.1”項下的方法制成供試溶液。 將供試品放置 0、2、4、6、12、24 h 后，分別精密量取這6種樣品溶液10μL，分別進樣[17]，記錄峰面積。峰面積的平均值為1 646 202，進而計算RSD=1.12%（＜2%）。結果表明，供試品在12 h內穩定性良好，可用于含量測定，結果準確可靠。

2.3.4 回收率的考察

使用分析天平精密量取已知含量的關木通粉末，過三號篩后，精密稱取5份，每份各1 g，分別精密添加相應量的對照品，制成溶液，測定含量，記錄，結果見表3。

表3 加樣回收率結果

3 討論

3.1 馬兜鈴酸的測定方法

由穩定性實驗結果顯示，供試品溶液放置0 h后測定與放置24 h后測定的相對標準差在誤差允許的范圍內，說明供試液在24 h內是穩定的，進一步說明此結果具有可信度。經查閱文獻可知，馬兜鈴屬的植物都含有馬兜鈴酸。因其具有羧基，所以在流動相中加入冰醋酸，分離度會提高20%，峰形也會得到改善。從實驗結果看，樣品的重復性好，穩定性好，可用于馬兜鈴酸的測定。本方法簡單、準確、快捷，可作為藥材關木通中馬兜鈴酸的含量測定方法。

3.2 炮制方法的合理性

關木通具有堅實的臨床基礎。自古以來因其具有毒性，人們常將其與其他藥材配伍使用。本實驗嚴謹地考察了藥材關木通炮制前后馬兜鈴酸含量的變化。結果顯示，炮制后馬兜鈴酸的含量比炮制前明顯降低，進一步說明通過炮制降低關木通毒性的合理性。

3.3 最佳炮制方法

從炮制品中馬兜鈴酸含量的測定結果可知，將醋炙法對馬兜鈴酸的脫除效果進行分析，結果較為理想。同時，該方法對浸出物的含量幾乎沒有影響。綜合各實驗結果可分析得出，最佳的炮制方法為醋炙。

3.4 本方法的優點

本實驗進一步證明，使用反相高效液相色譜法測定馬兜鈴屬藥材中馬兜鈴酸的含量及炮制品中馬兜鈴酸含量的方法合理、可行，而且具有準確性和靈敏度高的特點。在分離過程中，選擇梯度洗脫的方法，可最大程度地縮短馬兜鈴酸的分離周期，提高分離效率。

3.5 本實驗的不足

實驗過程發現，炮制時的溫度及時間也會極大程度地影響炮制后樣品中馬兜鈴酸的含量，還應采用正交試驗等多種方法對每種炮制方法的溫度、時間進行更深層次的計算與驗證，探究其他因素是否對馬兜鈴酸的含量也有較大影響。

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