魔芋低聚糖對三硝基苯磺酸致小鼠潰瘍性結腸炎的保護作用

馮 莉,安雪嬌,齊 妍,劉 昱,趙方慧,張 波

(北京聯合大學應用文理學院,生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191)

魔芋低聚糖對三硝基苯磺酸致小鼠潰瘍性結腸炎的保護作用

馮 莉,安雪嬌,齊 妍,劉 昱,趙方慧,張 波*

(北京聯合大學應用文理學院,生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室,北京 100191)

目的:初步探討魔芋低聚糖(KOGM)對三硝基苯磺酸(TNBS)誘導的小鼠潰瘍性結腸炎的保護作用。方法:將昆明小鼠隨機分為空白組、模型組、KOGM低劑量組和高劑量組。用100mg/kg bw TNBS和50%乙醇混合溶液造模。自造模24h后每天給小鼠灌胃KOGM直至處死。灌胃體積為10mL/kg bw。結果:各劑量組每日平均攝食量無顯著性差異,但與模型組比較,低、高劑量組食物利用率和體重增重均顯著升高;與模型組比較,低劑量組和高劑量組小鼠的結腸潰瘍面積及潰瘍率均明顯降低(p<0.01);結腸組織病理切片結果表明,KOGM高劑量組小鼠受損結腸恢復較好甚至接近正常狀態。結論:KOGM對小鼠潰瘍性結腸炎有一定的保護作用,其作用機理需進一步研究。

魔芋葡甘露低聚糖，潰瘍性結腸炎，小鼠，TNBS

魔芋葡甘露低聚糖(konjac oligo-glucomannan,KOGM)簡稱魔芋低聚糖,它是通過酶、酸、輻照等方法[1-3]降解天然魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan,KGM)而得到的。KOGM的應用有效地解決了KGM粘度過高,溶解度過小,食用后難消化以及易引起腹脹等一系列問題;另外,KOGM有促進益生菌生長、抑制病原菌、調節免疫、降低腸道排泄物毒性以及抗氧化等保健功效[4-7],因而可作為理想的食品原料或食品添加劑。

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種結腸和直腸慢性非特異性炎癥性疾病,病癥多為大腸粘膜及粘膜下層浸潤,典型臨床癥狀是間歇性腹瀉帶血、里急后重等。近年來UC在我國的發病率呈逐年上升趨勢。目前病因尚未十分清楚,且臨床上尚無有效的UC治療藥物及方法,但有研究報道顯示,UC可能與免疫、環境、遺傳等因素有關[8-9]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)誘導的小鼠UC模型是目前比較公認的模型,該方法操作簡便、效果明顯且穩定性高。本文采用TNBS誘導小鼠潰瘍性結腸炎,再灌胃不同劑量的KOGM,通過食物利用率、潰瘍率及組織病理切片等指標,探討魔芋低聚糖對結腸損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雌性昆明小鼠(25～27g,80只) 購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,使用許可證號為SYXK(京)2012-0031;魔芋低聚糖(KOGM) 成都永安制藥有限公司,低聚甘露糖(甘露二糖-甘露十糖)含量(以干基計)≥85%,其中聚合度2-6的寡糖含量≥50%,國家衛生計生委2013年第10號公告批準為新食品原料;2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) Aladdin試劑有限公司;無水乙醇 北京化工廠,分析純。

表1 魔芋低聚糖對小鼠體重、攝食量及食物利用率的影響±s)Table 1 Effects of KOGM on the body weight,the food intake and efficiency ratio of the female ±s)

注:與TNBS模型組比較,*:p<0.05,**:p<0.01。

全自動組織脫水機(ASP200)、石蠟包埋機冷臺(EG1150C)、石蠟包埋機熱臺(EG1150RH)、半自動輪轉式切片機(RM 2245)、攤片機(HI1210)、烘片機(HI1220)及全自動染色機(AUTOSTAINER XL) 德國Leica公司;三目倒置攝像生物顯微鏡系統(IX71) 日本OLYMPUS公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物飼養與分組 動物飼養環境為SPF級動物房。人工控制溫度為18～24℃,相對濕度為40%～70%,光照周期為14h光照(6:00 ～20:00)/10h黑暗,自由取食、飲水。普通飼料適應性飼養3d后,將80只健康小鼠隨機分為4組,分別為空白組、模型組、KOGM低劑量組和高劑量組(低、高劑量分別為2、6g/kg bw),每組20只。造模前禁食24h,自由飲水。模型組、低劑量組以及高劑量組分別一次性灌腸100mg/kg bw TNBS和50%乙醇溶液混合液,即將濃度為5%的TNBS水溶液、無水乙醇按體積比為1∶1混合,灌腸體積為4mL/kg bw,空白組灌腸等體積50%的乙醇溶液。

1.2.2 TNBS誘導結腸炎模型 參考徐陽等[10]的小鼠TNBS結腸炎模型的建立方法。造模前稱重,計算給藥劑量。小鼠禁食24h后,先用2%的戊巴比妥鈉,按2mL/kg bw腹腔注射麻醉小鼠,再用1mL連有灌腸針的微量注射器按體質量吸取灌腸液,小心將灌腸針探入小鼠肛門內,深至3～4cm,過程中避免碰傷腸壁,緩緩推入藥液。灌腸完畢后緩慢拔出灌腸針,為確保致敏液與腸道充分作用,將小鼠頭朝下,固定在一個45°角傾斜的平面上,靜置30min后,再進行一次同樣的給藥操作。小鼠蘇醒后,將小鼠放回籠中。空白組注入50%乙醇溶液。

1.2.3 魔芋低聚糖灌胃小鼠 灌胃前稱重小鼠,計算給藥劑量。自造模24h后,每天進行一次性灌胃KOGM,灌胃體積為10mL/kg bw。空白組及模型組均灌胃10mL/kg bw的去離子水。每天觀察并記錄動物的一般表現行為。每2天稱體重和食物攝入量,計算食物利用率。

1.2.4 動物處理 灌胃10d后,分別稱體重、攝食重。在第11d禁食16h后,稱空腹體重,頸椎脫臼處死。稱量胸腺、心、肝、脾、腎臟器絕對重量和計算臟/體比值。取結腸組織,用生理鹽水將腸內容物沖洗干凈,將每組中任意半數小鼠的結腸沿腸系膜剖開,用游標卡尺分別量取結腸總面積及潰瘍面積,潰瘍面積/總面積即為潰瘍率;剩余小鼠分別截取橫結腸中段1cm,浸泡于4%的福爾馬林溶液固定24h,石蠟包埋,常規切片,HE染色,觀察結腸組織結構。

2 結果與分析

2.1 魔芋低聚糖對小鼠體重、攝食量及食物利用率的影響

造模初期,造模組、空白組、KOGM低劑量組和高劑量組小鼠均出現懶動、少食、稀便、皮毛光澤度降低等癥狀,體重降低。第四天起,KOGM低劑量組和高劑量組小鼠基本恢復正常,空白組小鼠腹瀉、懶動等癥狀逐漸減輕;小鼠體重顯著增加,而模型組小鼠直到第五天體重才顯著增加。實驗結束時,與TNBS模型組比較,低劑量組和高劑量組小鼠的攝食量未見顯著性差異,但體重增重以及食物利用率顯著增加(p<0.05),提示KOGM能提高食物利用率,且這種作用與KOGM呈一定的劑量效應關系;另外,KOGM也有一定的增重效果,并且低劑量(2g/kg bw)作用更為明顯。結果見表1。

2.2 魔芋低聚糖對小鼠主要臟器的影響

造模組、空白組、KOGM 低劑量組和高劑量組小鼠的胸腺、心、肝、脾、腎臟重以及相應臟器系數均無顯著性差異,提示KOGM對小鼠的主要臟器沒有負面影響。結果見表2、表3。

表2 魔芋低聚糖對臟器重量的影響Table 2 Organ weight of experimental mice

表3 魔芋低聚糖對臟器系數的影響Table 3 Organ index of experimental mice

2.3 魔芋低聚糖對實驗動物結腸潰瘍的影響

模型組的潰瘍面積及潰瘍率均顯著高于空白組(p<0.01),表明造模成功。與模型組比較,KOGM低劑量組和高劑量組小鼠結腸的潰瘍面積及潰瘍率均顯著降低(p<0.01),表明KOGM能改善小鼠結腸的潰瘍狀況,可能對UC有一定的治療作用。結果見圖1。

圖1 魔芋低聚糖對結腸潰瘍的影響Fig 1 The ulcer status of colons on the groups of mice注:與空白組比較,**:p<0.01; 與模型組比較,##:p<0.01。

2.4 魔芋低聚糖對結腸組織學的影響

空白組小鼠結腸結構清晰,上皮完整,腺管排列規則,無炎細胞浸潤,杯狀細胞分布連續。模型組小鼠結腸上皮缺失,腺管扭曲且廣泛缺失,杯狀細胞丟失,粘膜下層水腫并伴有大量炎細胞,表明造模成功。KOGM高劑量組小鼠結腸上皮較完整,腺管排列較規則,杯狀細胞部分缺失,固有層有較少的炎細胞浸潤,粘膜下層存在少量炎細胞,表明KOGM有助于使受損的結腸恢復正常,可能對UC有較好的治療效果。結果見圖2。

圖 2 魔芋低聚糖對結腸組織學的影響Fig.2 Histological analysis of colons of the experimental mice注:A:空白組(×10);B:模型組(×10);C:高劑量組(×10); D:空白組(×20);E:模型組(×20);F:高劑量組(×20)。

3 討論

UC在我國的發病率逐年上升,其臨床癥狀輕重不一,以持續性腸道非特異性炎癥為特征,通常反復發作,臨床上無特效的治療手段,給患者帶來很大痛苦。采用非特異性抗炎和免疫抑制藥物是目前治療UC的主要方法,該法不良反應多,且無法根治。安全有效的療法是醫療工作者一直以來共同的追求。因此,探究UC的治療藥物具有重要意義。

UC與免疫調節密切相關[11]。研究表明[12],KOGM可增強ICR小鼠的細胞免疫功能和單核巨噬細胞吞噬功能,從而發揮免疫調節功效。

目前,乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌對UC的輔助治療作用已被多數人認可,許多研究者致力于腸道菌群和UC的相關機理研究。Zhao等[13]研究結果表明,Bifico膠囊(包括雙歧桿菌、乳酸桿菌和腸球菌)能顯著提高腸系膜淋巴結中的T細胞水平,調節結腸粘膜中Th1和Th2細胞因子的平衡,即使IL-2、IL-4和IL-10水平升高,使TNF-α和IFN-γ水平下降。也有研究顯示[14],小鼠攝入復合微生物制劑后,其中所含有的乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌可通過抑制UC小鼠的β-葡萄糖醛酸酶、髓過氧化物酶的活性達到緩解結腸炎癥狀的目的,而KOGM在體外和體內均能促進乳酸桿菌和雙歧桿菌等益生菌的大量繁殖[4,15-17],同時,KOGM(聚合度為5和10)經雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌分解所得到的產物具有較好的抗氧化能力,其主要是通過提高清除自由基的能力、減少脂類過氧化物的形成來實現抗氧化作用[7]。由此可見,KOGM具有改善UC癥狀的潛在功效,而國內外鮮有研究。

本實驗結果顯示,灌胃KOGM對TNBS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎有一定的改善作用,表現在KOGM能夠使小鼠結腸的潰瘍面積以及潰瘍率明顯降低,受損的結腸甚至可以恢復到接近正常狀態,這與以上的研究結果相吻合。

綜上所述,KOGM能夠緩解由TNBS引起的小鼠潰瘍性結腸炎,有望成為一種輔助治療人潰瘍性結腸炎的合生元,其作用機理可能與腸道菌群的平衡、Th1和Th2細胞因子的平衡等相關,還需進一步研究。

4 結論

本實驗初步證實KOGM能夠減輕小鼠UC癥狀,即稀便、懶動等,降低結腸的潰瘍面積及潰瘍率,使受損的結腸甚至恢復到接近正常狀態,為KOGM緩解UC作用提供了一些理論依據,同時為研制UC藥物指明了新方向。

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歐盟將實施食品安全標簽新標準

從2014年12月13日起，歐盟開始實施歐洲議會在2011年通過的一項食品標簽新標準，消費者將從標簽上得到更多、更詳細與食品相關的內容。

歐盟健康和食品安全委員會一位高級主管表示，食品標簽新標準是多年努力的結果，消費者可以了解到更多與食品安全相關的信息。新標準要求食品標簽必須清晰顯著，準確地標注食品中所含可能導致過敏的成分，對大部分經過加工的食品標注營養成分，對網購和店購采取統一標準，標明解凍食品和替代品等。歐盟成員國的食品產業有3年過渡期，而且允許已經上市的食品和在2014年12月13日之前已貼好標簽的食品一直賣完為止。

歐委會表示，會與食品生產和消費部門密切合作，以簡明易懂的方式實施新的食品安全標簽標準，并在2015年建成一個食品安全數據基地。

來源：慧聰食品工業網

Protective effect of konjac oligo-glucomannan on trinitrobenzene sulfonic acid-induced ulcerative colitis in mice

FENG Li,AN Xue-jiao,QI Yan,LIU Yu,ZHAO Fang-hui,ZHANG Bo*

(College of Arts and Science of Beijing Union University,Key Laboratory for Bioactive Substances and Functional Foods,Beijing 100191,China)

Objective:To investigate the protective effects of konjac oligo-glucomannan(KOGM)on the ulcerative colitis(UC)induced by trinitro benzene sulfonic acid(TNBS)in mice. Methods:Kunming mice were randomly divided into control group,model group,KOGM low dose group and high dose groups. The mixed solution including 100mg/kg bw TNBS and 50% ethanol was used for model building. After 24 hours,the high dose and low dose group were administrated with KOGM by gavage,and the volume was 10mL/kg bw. Results:There was no evident differences about average daily intake among groups,but compared with the model group,food efficiency ratio and body weight gain were significantly increased in both low dose and high dose groups. Compared with the model group,the ulcer areas and rates of the colon in low dose and high dose group were significantly decreased(p<0.01). The results of histopathological slice of colon showed that the damaged colon of high dose group were recovered better,even close to a normal state. Conclusion:KOGM had a protective effect for ulcerative colitis injury in mice,and the mechanism should be further explored.

Konjac mannan oligosaccharides;ulcerative colitis;mice;TNBS

2014-04-08

馮莉(1988-)，女，碩士研究生，研究方向:生物活性物質的功能與毒理。

*通訊作者:張波(1962-)，女，博士，教授，研究方向:生物活性物質的功能與毒理。

“十二五”國家科技支撐計劃課題資助(2012BAD33B06)，北京聯合大學“啟明星”大學生科技創新項目(市級)資助。

TS201.4

A

1002-0306(2015)01-0349-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.065