食源性MRSA氨基糖苷類耐藥基因多重PCR方法建立

戰曉微,鄭秋月,傅俊范,徐君怡,陳 璐,董姝君

(1.沈陽農業大學,植物保護學院,遼寧沈陽 110866;2.遼寧出入境檢驗檢驗局,遼寧大連 116001;3.沈陽市排水管理處,遼寧沈陽 110000;4.大連市第二十四中學,遼寧大連 116001)

食源性MRSA氨基糖苷類耐藥基因多重PCR方法建立

戰曉微1,鄭秋月2,*,傅俊范1,徐君怡2,陳 璐3,董姝君4

(1.沈陽農業大學,植物保護學院,遼寧沈陽 110866;2.遼寧出入境檢驗檢驗局,遼寧大連 116001;3.沈陽市排水管理處,遼寧沈陽 110000;4.大連市第二十四中學,遼寧大連 116001)

目的:了解食源性金黃色葡萄球菌中耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)及對氨基糖苷類慶大霉素、卡那霉素抗生素的耐藥性情況,并建立快速檢測鑒定金黃色葡萄球菌耐藥性多重PCR方法。方法:對金黃色葡萄球菌進行增菌培養,并提取DNA作為模板,以nuc基因作為菌屬鑒定基因,mecA基因作為MRSA檢測基因,aacA-aphD及aph(3′)-Ⅲa基因作為耐氨基糖苷類慶大霉素、卡那霉素的檢測目的基因,建立四重PCR檢測方法并進行特異性及靈敏度評價;利用所建立的方法檢測72株食品及食物中毒患者來源的金黃色葡萄球菌。結果:成功建立四重PCR檢測方法,且72株金黃色葡萄球菌均有nuc基因檢出,mecA基因與MRSA檢測符合率達100%,aacA-aphD、aph(3′)-Ⅲa基因與慶大霉素、卡那霉素耐藥菌株的符合率達95.12%。結論:本實驗所建立的多重PCR方法靈敏度高、特異性好,可以快速檢測出MRSA,并對氨基糖苷類慶大霉素、卡那霉素耐藥菌株檢測具有較高的準確率。

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌,氨基糖苷類,耐藥基因

隨著抗生素的廣泛使用,食源性金黃色葡萄球菌耐藥株、多重耐藥株廣泛流行,其中被稱為“超級細菌”的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant S.aureus,MRSA)常表現為多重耐藥,其具有傳染力強、多重耐藥性、致病毒力因子多等特點[1],成為臨床抗感染治療的一大難題[2]。另外,由于MRSA常表現為對氨基糖苷類、大環內酯類、四環素類等其他多種抗生素同時耐藥[3],因此,由MRSA其引起的感染常難以控制。MRSA的耐藥性與mecA基因編碼的青霉素結合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)密切相關[4],因此,mecA檢測通常被認為是檢測MRSA的“金標準”。MRSA自1961年Jevons首次報道以來,在世界各地相繼出現,近年來,隨著醫院內MRSA感染的日益嚴重,其在豬、牛等家畜中呈高流行率,且該菌是引起牛乳房炎最主要的病原菌之一[5],由于動物源性細菌和耐藥基因可以通過食物鏈傳播,會對人類健康造成嚴重危害[6]。

表1 四種引物序列Table 1 Sequences of four sets of primers for target genes

由于氨基糖苷類抗生素近年來被大量使用于抗金黃色葡萄球菌,使其耐藥菌株逐漸出現,且有報道稱豬源MRSA中對氨基糖苷類卡那霉素、慶大霉素、托普霉素和新霉素等的耐藥性為30%左右[7-8],多重耐藥現象大大增加了人類感染后治愈的難度。氨基糖苷修飾酶(AME)的產生是細菌對氨基糖苷抗菌藥物耐藥的主要機制,AME主要有3種:氨基糖苷乙酰轉移酶(AAC)、氨基糖苷核甙轉移酶(ANT)和氨基糖苷磷酸轉移酶(APH),共30多種基因型,并不斷有新的基因型發現。產廣譜氨基糖苷修飾酶AAC(6′)-APH(2′)是金黃色葡萄球菌耐氨基糖苷類抗生素的主要原因,該酶是國內多數地區主要流行AME類型,可由aacA-aphD基因編碼[9];其次流行的AME是APH(3′)酶,該酶可由aph(3′)-Ⅲa基因編碼[10]。

本文利用多重PCR方法,針對金黃色葡萄球菌的特異性nuc基因,MRSA的耐藥決定因子mecA基因及耐慶大霉素/卡那霉素基因(aacA-aphD、aph(3′)-Ⅲa)建立多重PCR快速檢測方法,以快速鑒定出金黃色葡萄球菌,并檢測MRSA及耐慶大霉素/卡那霉素金黃色葡萄球菌。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 72株金黃色葡萄球菌(來源見表3);耐氨基糖苷類抗生素MRSA,金黃色葡萄球菌ATCC25923,大腸桿菌1株、沙門氏菌1株、單增李斯特菌1株、副溶血性弧菌1株、糞腸球菌1株、銅綠假單胞菌1株(均由本實驗室保存)。

培養基 營養瓊脂,Mueller-Hinton(M-H)培養基,baird parker瓊脂(B-P),胰蛋白胨大豆瓊脂培養基(TSA),胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)美國BD公司。

苯唑西林(OXA)、頭孢西丁(CFX)、慶大霉素(GEN)、卡那霉素(KAN)、妥布霉素(TOB) 杭州天和微生物;prepman uitra 細菌提取試劑 美國AB公司;TaqDNA聚合酶,dNTPmixture,DNA marker,Goldview 大連寶生物公司;PCR引物 由大連寶生物公司合成。

微生物自動鑒定系統 PHOENIX-100,美國BD公司;PCR擴增儀 TC3000G,英國TECHNE公司;超微量紫外可見光分光光度計 NANODROP2000C,Thermo公司;電泳儀 600SI,上海博彩生物科技有限公司;凝膠成像系統 GBOX-F3,GENE公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌鑒定及藥敏實驗 根據金黃色葡萄球菌檢驗GB 4789.10-2010方法分離鑒定金黃色葡萄球菌,根據《動物及其制品中細菌耐藥性的測定紙片擴散法》SN/T1944-2007方法檢測菌株對苯唑西林,頭孢西丁,慶大霉素、卡那霉素、妥布霉素抗生素的耐藥性,參照美國臨床和實驗室標準研究所(CLSI)的解釋標準及M100-S23的更新內容進行結果判讀[11-13],質量控制與細菌耐藥性測定同步進行,測量質控菌株的抑菌環,其直接應在規定范圍之內,操作方法及質控菌株抑菌環直徑限度范圍參見SN/T1944-2007方法。質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923。

1.2.2 多重PCR方法建立 以prepman uitra 細菌提取方法提取細菌DNA,使用紫外分光光度計分別測定吸收波長260nm及280nm的OD值,當OD260/OD280的比值在1.6～1.9之間時,表明細菌DNA適宜進行PCR實驗;利用公式OD260×稀釋倍數×50/1000計算DNA濃度,-20℃保存。

[14-17],設計合成檢測引物(表1),參照TAKARA公司TaqTM操作說明書配制PCR反應液,并調整各引物濃度,確定四重PCR反應體系為:Taq聚合酶0.25μL,10×buffer 5μL,dNTP mixture 4μL,nuc、mecA、aph(3′)-Ⅲa、aacA-aphD四種引物添加量分別為2.4、2.4、2.4、0.8μL(10μmol/L),DNA 5μL,dH2O補足至50μL。將PCR反應液于PCR擴增儀進行PCR擴增,反應條件為:94℃,3min;94℃,1min,55℃,1min,72℃,1min,35個循環;72℃,7min。取PCR產物10μL上樣,進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,3%瓊脂糖電泳,電壓為200V,電流190mA,電泳時間為20min,電泳結束后,將膠置于凝膠成像系統下鑒定。針對nuc、mecA、aph(3′)-Ⅲa、aacA-aphD四種引物進行單一PCR擴增及電泳檢測,同時將攜帶有mecA、aph(3′)-Ⅲa、aacA-aphD基因的陽性菌株混合后進行DNA提取,并進行PCR檢測,同時設置陰性對照。

表2 金黃色葡萄球菌在不同稀釋度下的細菌數量(單位:cfu/mL)Table 2 The number of bacteria in different dilution for S.aureus(cfu/mL)

表3 72株金黃色葡萄球菌分離株耐藥性檢測結果及來源Table 3 The detection results of antibiotic resistance and origin of 72 strains for S. aureus

1.2.3 四重PCR檢測方法的應用 利用所建立的四重PCR檢測方法對與食品相關的不同來源的72株金黃色葡萄球菌進行檢測,同時用全自動微生物鑒定系統和紙片擴散法進行檢測,比較檢測結果,確定所建立的方法與經典檢測方法的符合率,評價其可靠性及實用性。

2 結果與分析

2.1 四重PCR檢測方法特異性及靈敏度

提取DNA,根據已建立的PCR檢測方法進行PCR擴增并電泳檢測,結果(圖1)顯示金黃色葡萄球菌可擴增出PCR片段,而大腸桿菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌未擴增出,表明建立的方法對金黃色葡萄球菌具有較好的特異性。

圖1 四重PCR檢測方法特異性試驗Fig.1 Specificity test of multiple PCR detection method注：1.金黃色葡萄球菌;2.大腸桿菌;3.沙門氏菌; 4.單增李斯特菌;5.副溶血性弧菌;6.糞腸球菌; 7.銅綠假單胞菌；泳道1中擴增條帶依次為 523,400,310,227bp。

經梯度稀釋后檢測金黃色葡萄球菌增菌液的細菌數量,其不同稀釋度下的細菌數量見表2,利用本實驗所建立的方法對不同稀釋度下的金黃色葡萄球菌進行DNA提取并PCR檢測,多重PCR檢測結果(圖2)顯示,本實驗所建立的多重PCR檢測方法可檢測到10-5稀釋倍數的菌液(細菌數量為2.3×103cfu/mL)。

圖2 四重PCR檢測方法靈敏度試驗Fig.2 Sensitivity test of multiple PCR detection method注：1. 2.3×108cfu/mL;2. 2.3×107cfu/mL; 3. 2.3×106cfu/mL; 4. 2.3×105cfu/mL;5. 2.3×104cfu/mL; 6. 2.3×103cfu/mL。

2.2 四重PCR檢測方法應用

通過金黃色葡萄球菌檢驗方法GB 4789.10-2010分離出的72株不同來源的金黃色葡萄球菌經全自動微生物鑒定系統確定,該72株菌均為金黃色葡萄球菌屬。利用本實驗建立的多重PCR方法檢測此72株菌,其中72株金黃色葡萄球菌均檢出nuc基因,檢出42株菌攜帶mecA基因,38株菌攜帶aacA-ahpD基因,3株菌攜帶aph(3’)-Ⅲa基因,其中2株菌同時攜帶aacA-ahpD基因和aph(3’)-Ⅲa基因(結果見表3,圖3)。

續表

續表

圖3 金黃色葡萄球菌PCR檢測結果Fig.3 PCR detection results of staphylococcus aureus

注：耐藥基因型結果:+表示PCR陽性,-表示PCR陰性;耐藥表型結果:R表示耐藥,I表示中介,S表示敏感。

3 討論

本實驗中,對72株金黃色葡萄球菌進行紙片擴散法及全自動微生物鑒定系統進行耐藥表型檢測,結果表明,攜帶mecA基因的金黃色葡萄球菌對苯唑西林及頭孢西丁均顯示為耐藥及中介耐藥,而未攜帶mecA基因的金黃色葡萄球菌對苯唑西林及頭孢西丁均顯示為敏感,說明多重PCR方法對MRSA的檢測與耐藥表型檢測方法的結果一致。只攜帶氨基糖苷類耐藥基因aacA-ahpD的金黃色葡萄球菌共36株,其中有3株對慶大霉素耐藥對卡那霉素敏感,有5株對慶大霉素敏感對卡那霉素耐藥,有28株對慶大霉素、卡那霉素均耐藥;只攜帶氨基糖苷類耐藥基因aph(3′)-Ⅲa的金黃色葡萄球菌有1株,該菌對卡那霉素耐藥,對慶大霉素敏感;同時攜帶兩種氨基糖苷類耐藥基因aacA-ahpD和aph(3′)-Ⅲa的金黃色葡萄球菌為2株,其中1株對慶大霉素、卡那霉素均耐藥,1株對卡那霉素耐藥同時對慶大霉素敏感。由此可知,多重PCR方法檢測出的攜帶氨基糖苷類耐藥基因均對卡那霉素、慶大霉素兩種抗生素中至少一種抗生素耐藥,說明本方法對檢測氨基糖苷類耐藥菌株與傳統方法檢測結果一致。此外,另有1株食物中毒患者來源的金黃色葡萄球菌對卡那霉素敏感且對慶大霉素耐藥;1株食品工作人員來源的金黃色葡萄球菌對卡那霉素及慶大霉素均耐藥,未檢出aacA-ahpD、aph(3′)-Ⅲa兩種基因。因此,此72株金黃色葡萄球菌中39株攜帶至少一種氨基糖苷類耐藥基因的耐藥菌株與利用紙片擴散法檢測的耐藥表型結果一致,而有2株耐藥表型為氨基糖苷類耐藥人體分離株未檢出aacA-aphD、aph(3′)-Ⅲa兩種基因,耐藥基因型和耐藥表型的符合率達95.12%(39/41)。

MRSA及氨基糖苷類耐藥菌株是目前金黃色葡萄球菌耐藥菌株的常見類型,在進出口食品檢疫中,尤其是對動物源性食品中耐藥菌株的檢測和預防更為關鍵。王偉等2013年報道877株金黃色葡萄球菌中豬源性菌株中MRSA檢出率為20.6%,而食源性菌株的MRSA的檢出率為3.6%[18]。燕霞等2012年報道浙江省奶牛養殖區的70株牛源金黃色葡萄球菌對慶大霉素的耐藥率為67.1%[19]。面對該類耐藥菌株高流行率的嚴峻現實,本實驗建立的PCR方法通過檢測耐藥基因確定細菌耐藥性,具有快速穩定的優勢,彌補了食品檢疫中紙片擴散法通過耐藥表型判斷耐藥的檢測方法耗時長、穩定性差等不足,同時也保障了食品檢測中耐藥菌株檢測的準確性。

目前,金黃色葡萄球菌耐藥性的檢測方法主要有耐藥表型和耐藥基因型檢測兩類,其中主要包括紙片擴散法、MIC稀釋法等方法的耐藥表型檢測目前仍是臨床微生物耐藥性檢測的主要方式[20],而對于食源性、動物源性的金黃色葡萄球菌的耐藥性檢測標準仍以紙片擴散法為主,盡管傳統手工藥敏實驗方法檢測細菌耐藥表型的方法較完善,且由于價格低廉,應用廣泛,但仍然存在操作繁瑣,耗時長,且受人為因素影響較大等問題,同時由于紙片擴散法主要是為抗生素滅菌提供參考,研究分離菌株對抗生素的耐受情況,而不是直接評估體外細菌耐藥株對人體的影響,因此,針對耐藥基因型檢測的方法可有效地預防攜帶耐藥基因的耐藥菌株危害人類,且以PCR方法為基礎的分子生物學技術檢測細菌耐藥基因的方法不但能夠快速可靠地檢測細菌耐藥性,有效地避免手工藥敏檢測方法假陰性、假陽性的現象,也為細菌耐藥機制的研究提供了有力工具[21]。

我國對金黃色葡萄球菌耐藥菌株造成的公共衛生及食品安全問題雖然高度關注,但目前尚無一種快速準確穩定的檢測方法。本研究建立的金黃色葡萄球菌,MRSA及氨基糖苷類耐藥菌株多重PCR檢測為實際檢測提供了一種快速有效的方法。對耐藥菌株不斷增加的嚴峻形勢,有必要盡快開展相關監測工作和技術儲備,以便應對國際貿易中耐藥性細菌對我國食品安全的沖擊。

4 結論

根據本文所建立的多重PCR方法檢測不同來源的72株金黃色葡萄球菌野生分離株發現,其中nuc基因、mecA基因檢測結果與傳統方法的檢測結果符合率達100%,而攜帶氨基糖苷類耐藥基因aacA-aphD、aph(3′)-Ⅲa的菌株與傳統方法檢測的耐藥表型檢測結果一致,說明本方法對檢測aacA-aphD、aph(3′)-Ⅲa基因型的耐氨基糖苷類抗生素的金黃色葡萄球菌具有準確穩定快速的檢測能力,此外,兩株由人體分離的金黃色葡萄球菌耐藥表型為氨基糖苷類抗生素耐藥,但未檢出aacA-aphD、aph(3′)-Ⅲa基因,可能由于該耐藥菌株為其他耐藥基因型或其他耐藥機制引起,在未來的工作中將進一步研究。

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2016年4月24日播種蕹菜育苗，5月24日移栽。供試材料處理和施基肥、追肥、取土樣、撈剩余秸稈的方式，以及采收標準等均按文獻[10]的方法進行。根據蕹菜茬口共計栽培138 d，分別于6月17日、7月4日、7月22日、8月8日、8月27日、9月17日和10月8日共采收7次。

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Establishment of Aminoglycoside resistance gene of foodborne MRSA detection method by Multiple-PCR

ZHAN Xiao-wei1,ZHENG Qiu-yue2,*,FU Jun-fan1,XU Jun-yi2,CHEN Lu3,DONG Shu-jun4

(1.Shenyang Agricultural University,College of Plant Protection,Shenyang 110866,China;2. Liaoning Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Dalian 116001,China;3. Shenyang Municipal Drainage Management,Shenyang 110000，China；4. Dalian NO.24 High School,Dalian 116001,China)

Objective:To investigate the prevalence of methicillin-resistantStaphylococcusaureusMRSA and resistance to Aminoglycoside gentamicin,kanamycin in foodborneS.aureus,and establish a rapid quadruple-PCR method for detection and identification antibiotic resistance ofS.aureus. Methods:Genomic DNA was extracted as template for PCR fromS.aureusrecoveried and cultured in enrichment medium. According to nuc for Genus,mecA for MRSA,aacA-aphD and aph(3′)-Ⅲa for Gentamicin and kanamycin,quadruple-RCR detection method was developed,its sensitivity and specificity were evaluated;a total of 72 strains ofS.aureusfrom food and patients with food poisoning were detected by quadruple RCR method. Results:Quadruple-RCR detection method was established. 72 strains ofS.aureusall had nuc,the coincidence rate of mecA and MRSA was 100%,the coincidence rate of aacA-aphD,aph(3’)-Ⅲa and gentamicin,kanamycin was 95.12%. Conclusion:this established quadruple-RCR method was specific,sensitive. MRSA could be tested rapidly,and there was high accurate rate for detection of gentamicin,kanamycin resistant strains ofS.aureus.

MRSA;aminoglycoside;resistant gene

2014-01-21

戰曉微(1986-),女,博士,研究方向:有害生物與環境安全。

*通訊作者:鄭秋月(1972-),女,博士,高級工程師,研究方向:食品安全檢測與研究。

科技部質檢公益性專項課題(201210043)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0303-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.055