Rhizopusoryzae LS-1利用丟糟水解液發酵生產乳酸

田艷花,任海偉,劉娜麗

(1.山西藥科職業學院食品工程系,山西太原 030031;2. 蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

RhizopusoryzaeLS-1利用丟糟水解液發酵生產乳酸

田艷花1,任海偉2,*,劉娜麗1

(1.山西藥科職業學院食品工程系,山西太原 030031;2. 蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050)

研究了一株誘變米根霉RhizopusoryzaeLS-1利用丟糟水解液發酵生產乳酸的可行性。首先考察R.oryzaeLS-1利用葡萄糖和木糖的糖代謝差異特性,并通過正交實驗優化丟糟水解液發酵生產乳酸的工藝參數。結果表明,R.oryzaeLS-1能代謝利用葡萄糖和木糖,且二者存在協同互補作用,有利于乳酸生成和糖酸轉化,可用于木質纖維原料的乳酸生產。丟糟水解液發酵生產乳酸的實驗表明,氯化銨是R.oryzaeLS-1適宜的氮源。在接種量為3.0%、pH為6.5、發酵時間為96h、CaCO3添加量為80g/L的條件下,乳酸生成濃度為13.27g/L,糖利用率為79.61%。說明誘變菌株R.oryzaeLS-1具備發酵丟糟水解液制備乳酸的潛力。

丟糟水解液,米根霉,乳酸發酵

乳酸是一種重要的多用途有機酸,學名2-羥基丙酸,被廣泛用于食品、醫藥、飼料、化工等領域。尤其引人關注的是,乳酸聚合而成的聚乳酸(PLA)作為無毒、無刺激、高強度的生物相容性高分子材料能用做制造生物可降解塑料、綠色包裝材料和藥用修復材料等,應用前景廣闊[1]。

乳酸生產有化學合成法、酶轉化法以及微生物發酵法。其中,微生物發酵法因其原料來源廣泛、生產成本低、產品光學純度高、安全性好等優點已成為主要的乳酸生產方法。目前報道的乳酸發酵微生物有絲狀真菌(Rhizopusoryzae、R.stolonifer、R.ritici,R.elegans)、細菌(lactic acid bacteria,Bacillusspecies)和基因工程菌(Pichiastipitis,Corynebacteriumglutamicum,Candidautilis,Escherichiacoli)等[2]。其中,乳酸菌(Lactobacillus,Lactococcus,Streptococcus,Leuconostoc,Enterococcus)對營養環境和生長培養基的要求嚴格,只能在氨基酸、維生素和其他生長因子具備的培養基中生長,且產物多為乳酸的外消旋混合物,使得生產和分離純化成本提高。與之相比,米根霉(Rhizopusoryzae)發酵生產的乳酸具有光學純度高、營養需求簡單、好氧發酵及產物容易提純等優點,是工業生產高光學純度乳酸的理想菌株[3]。

木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素組成,可降解轉化為富含葡萄糖和木糖的混合糖基質用于乳酸發酵生產[4],是乳酸工業化生產的重要原料,如農作物秸稈(麥秸、玉米秸等)[5-6]、玉米芯[7]、木材[8]、廢棄報紙[9]、蔗渣[10]等。中國是白酒生產和消費大國。白酒釀造副產物——丟糟不僅產量巨大,資源豐富,而且纖維素和半纖維素含量高達60%以上,是一種亟待開發的木質纖維素資源。若能將其降解糖化后用于發酵生產乳酸,不僅能拓寬乳酸的生產原料來源,降低原料成本,而且對減少工業廢棄物污染具有積極意義。

本文以1株誘變的米根霉(Rhizopusoryzae)LS-1為發酵菌種,首先研究了R.oryzaeLS-1的葡萄糖和木糖代謝特性,并以丟糟水解液為原料,選取乳酸濃度和總糖利用率為評價指標,考察了氮源種類、發酵時間、接種量、pH和CaCO3添加量等參數對乳酸發酵工藝的影響,探索丟糟用于乳酸發酵的可行性,為丟糟利用和白酒釀造企業循環發展提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

丟糟,甘肅金徽酒股份有限公司提供。鮮酒糟自然風干后粉碎過50 目篩備用。基本成分為(以干基計):蛋白質質量分數為16.42%±0.03%,淀粉質量分數為14.81%±0.09%,粗脂肪質量分數為3.56%±0.02%,纖維素質量分數為53.17%±1.26%,半纖維素質量分數為12.86%±0.06%。

米根霉(Rhizopusoryzae)LS-1(CICC41411的誘變菌種) 蘭州理工大學生命科學與工程學院保藏。

HH-4數顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司;SHD-III 型循環水式多用真空泵 保定高新區陽光科教儀器廠;TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠;GZX-9240MBE 數顯鼓風干燥箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠;Cary 50 紫外可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司;SHZ-82氣浴恒溫振蕩培養箱 江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司。

1.2 培養基

菌種保藏斜面培養基:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基;種子培養基(g/L):葡萄糖 50;(NH4)2SO44;KH2PO40.6,MgSO4·7H2O 0.25,ZnSO4·7H2O 0.44,CaCO310(添加1/10體積的10% CaCO3懸浮液單獨滅菌,用于調節pH);生長培養基(g/L):葡萄糖120,(NH4)2SO41,KH2PO40.5,MgSO4·7H2O 0.5,ZnSO4.7H2O 0.04,CaCO325。

1.3 實驗方法

1.3.1 分析方法 乳酸測定采用對羥基聯苯比色法;木糖測定采用間苯三酚法;總糖(以還原糖計)測定采用DNS法。

1.3.2 液體種子培養方法 LS-1米根霉在PDA斜面培養基上32℃培養5～7d,制備孢子懸浮液。250mL三角瓶中裝入50mL種子培養基,接種5mL孢子懸液,在32℃、220r/min條件下振蕩培養48h,得到液體種子,計算孢子濃度為5×106個/mL。

1.3.3 糖代謝特性研究 設置不同的C/N比值,考察碳源種類分別為葡萄糖、木糖或混合糖(m葡萄糖∶m木糖=1∶1)條件下米根霉的糖代謝特性。糖濃度分別為90、100、110、120、130、140g/L,培養過程中選擇氮源為氯化銨,氯化銨添加量以N濃度計為3.5g/L。培養條件為:250mL三角瓶中裝入50mL未加碳源的生長培養基,接種量為5%,32℃搖床培養72h,轉速220r/min。發酵結束后計算糖酸轉化率和糖利用率。計算公式如下:

糖利用率(%)=初始糖質量(g)-終了糖質量(g)/初始糖質量(g)×100

(1)

(2)

1.3.4 丟糟水解液發酵制備乳酸的工藝參數優化

1.3.4.1 單因素實驗 參考文獻[11]方法制備丟糟水解液,經測定葡萄糖濃度為15.28g/L,木糖濃度為4.73g/L,總糖濃度為22.19g/L。

采用250mL三角瓶裝液50mL進行發酵。準確量取50mL丟糟水解液,依次添加KH2PO4、MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O,使其濃度分別為0.5g/L、0.5g/L和0.04g/L。滅菌后接入種子培養液進行乳酸發酵,發酵溫度32℃,搖床轉速為220r/min。發酵結束后,取發酵樣液5000r/min、4℃離心10min,取適量上清液測定乳酸濃度和總糖濃度,并按照公式(1)計算糖利用率。

a.氮源種類對乳酸發酵的影響

在總糖濃度為100g/L、碳源為葡萄糖和木糖(m葡萄糖∶m木糖=1∶1)的條件,考察硫酸銨(AS)、氯化氨(AC)、尿素(UR)、蛋白胨(PE)和酵母抽提物(TE)等5種氮源對乳酸濃度和糖利用率的影響,上述5種氮源的添加量均以N濃度計(3.5g/L)。

篩選出適宜的氮源種類后,在相同碳源(同上)和氮源為氯化氨(AC添加量以N濃度計為3.5g/L)條件下,進行乳酸發酵工藝參數的單因素和正交優化實驗。

b.pH對乳酸發酵的影響

固定CaCO3添加量70g·L-1,發酵時間96h,接種量2.5%,研究不同pH(4.5、5.0、5.5、6.0和6.5)對米根霉發酵的影響。

c.接種量對乳酸發酵的影響

固定CaCO3添加量70g·L-1,pH6.0,發酵時間96h,研究不同接種量(1.0%、1.5%、2.0%、2.5%和3.0%)對米根霉發酵的影響。

d.發酵時間對乳酸發酵的影響

固定CaCO3添加量70g·L-1,pH6.0,接種量2.5%,研究發酵時間(12、24、36、48、60、72、84、96和108h)對米根霉發酵的影響。

e.CaCO3添加量對乳酸發酵的影響

固定pH6.0,接種量2.5%,發酵時間96h,研究CaCO3添加量(40、50、60、70和80g/L)對米根霉發酵的影響。

1.3.4.2 正交實驗優化設計 在單因素實驗的基礎上,選取CaCO3添加量、pH、接種量和發酵時間4個因素進行L9(34)正交實驗,各取3個水平,優化發酵參數,并進行驗證實驗。

表1 正交實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal tests

1.4 數據統計分析

實驗數據表示為平均值±標準差,采用SPSS軟件處理,置信水平為95%時,p<0.05說明數據在統計學上存在顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 米根霉糖代謝特性研究

木質纖維素的降解產物是以葡萄糖和木糖為主的混合糖,為更好地將其作為發酵基質,研究了米根霉發酵葡萄糖、木糖或混合糖(葡萄糖∶木糖=1∶1)的糖代謝情況。由圖1可見,葡萄糖或木糖單獨作為碳源時的糖利用率和糖酸轉化率基本相同,但混合糖發酵的糖酸轉化率和糖利用率均明顯提高,尤其糖酸轉化率成倍增長。因為,二者代謝途徑存在差異,葡萄糖代謝主要與糖酵解途徑相關,純葡萄糖培養條件下,不斷下降的體系pH對菌體生長產生了抑制作用,使菌體生物量偏低,造成糖利用率和糖酸轉化率偏低;而米根霉代謝木糖時會產生較高的胞內還原力(NADH/NAD+)和ATP,代謝反應以促進細胞生物量的合成以及細胞大分子組分的合成為主,指向生物量積累的能量代謝旺盛[12-13]。另一方面,與葡萄糖相比較,米根霉發酵木糖所需要的C/N比較低,積極有效的呼吸作用比葡萄糖基質更重要,而木糖代謝過程中的氧化還原途徑與較高的呼吸通量有關系[14]。因此,米根霉R.oryzaeLS-1不僅可以發酵葡萄糖和木糖,且二者共存時還可以提高糖酸轉化率,對乳酸發酵具有協同促進作用。

圖1 不同碳源條件下的米根霉糖代謝特性Fig.1 Sugar metabolism of Rhizopus oryzae LS-1 for different carbon sources

2.2 米根霉發酵丟糟水解液產乳酸工藝研究

2.2.1 氮源種類對丟糟水解液發酵乳酸的影響 氮源不僅對微生物合成細胞物質至關重要,而且是一種成本較高的培養基組分。為了降低發酵成本,研究了硫酸銨(AS)、氯化氨(AC)、尿素(UR)、蛋白胨(PE)和酵母抽提物(TE)五種氮源對乳酸發酵的影響。氮源量均以N濃度計(3.5g/L)。

由圖2可知,無氮源添加時,乳酸濃度僅為2.52 g·L-1,糖利用率為12.35%;添加氮源后均能不同程度地提高乳酸濃度和糖利用率。因為豐富的N源為生物大分子如蛋白質、脂肪等提供了充足的原料,從而促進米根霉糖酸轉化率的提高。然而,不同氮源對乳酸發酵的影響各有差異,其中氯化銨對應的乳酸濃度和糖利用率最高,說明與其它四種氮源相比,氯化銨能更多地促進乳酸合成。該結果與硫酸銨是最適宜氮源的研究結果不一致,這可能是由于培養基成分不同所致[15],因為培養基營養成分會通過影響乳酸菌形態來影響發酵過程和乳酸產量。另外,總體比較而言,盡管有機氮源富含礦物質、維生素和糖分,但無機氮源更有利于促進乳酸生成。從培養基成本和氮源作用效果等角度衡量,本實驗選用氯化銨作為培養基中的氮源。

圖2 氮源種類對乳酸發酵的影響Fig.2 Effects of nitrogen sources on the fermentation of lactic acid

2.2.2 pH對丟糟水解液發酵乳酸的影響 微生物生存環境中的pH對微生物的活動影響很大,主要作用在于引起細胞膜電荷變化,從而影響微生物對營養物質的吸收;影響代謝過程中酶的活性;改變生長環境中營養物質的可給性以及有害物質的毒性。因此,適宜的pH能使菌體獲得最佳培養效果。由圖3可以看出,隨著體系pH不斷升高,乳酸濃度和總糖利用率均逐漸增加,說明pH升高有利于乳酸的生成。當pH為6.0時,乳酸產量最高為10.82g/L,對應的總糖利用率也達到峰值75.33%。當pH升至6.5時,乳酸濃度顯著降低,總糖利用率也隨之減小,這可能是長時間高pH環境嚴重影響了菌體的生長及發酵產酸過程。但另一方面,發酵過程中產生的乳酸也會造成體系pH自動下降,對糖利用效率和乳酸的合成產生較大影響。因此,適當高的初始pH不僅能縮短菌體生長的遲滯期,而且還能使發酵體系維持較長時間的良好環境,避免過早發生產物抑制現象,有利于米根霉的發酵代謝。故發酵初始pH確定為6.0,這與Martak J等[16]米根霉生長最適pH范圍5.0～6.0的研究結果相一致。

圖3 初始pH對乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.3 Effects of pH on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.2.3 接種量對丟糟水解液發酵乳酸的影響 接種量是由發酵時菌體生長繁殖的速度決定的,通常較大的接種量可以縮短生長周期,使產物合成提前,但接種量過大也可能使菌體生長過快,造成溶氧量不足,從而影響產物合成。由圖4可知,隨著接種量的增加,乳酸濃度和總糖利用率均逐漸升高,二者變化趨勢基本一致,當接種量為2.5%時的乳酸濃度和總糖利用率均達到最大值,分別為9.06g/L和62.90%,當接種量提高到3.0%時,二者反而降低。實驗過程中觀察發現,接種量的大小影響菌體形態。隨著接種量的不斷提高,菌絲體越易聚集成較大的絮狀菌團。因為過高的接種量容易導致過高的菌絲體生長密度,進而導致發酵液粘度過高,而相對較低的攪拌轉速(220r/min)所產生的剪切力,也不足以克服菌絲之間由Ca2+介導的靜電引力,從而使得菌絲體聚集成較大的絮狀菌團。絮狀菌團導致發酵體系的傳質效率降低,乳酸產量下降。另一方面,盡管過高的接種量會縮短延遲期時間,菌體進入快速生長期,但菌體大量繁殖,也會產生過多的代謝副產物,反而抑制乳酸的形成。Bai等[17]研究發現,接種量過小,米根霉呈現絲狀菌絲形態,接種量過高,菌絲發生聚集形成菌塊,造成氧氣和營養成分的傳質受限引起菌會內部發生自溶現象。因此,選定接種量為2.5%。

圖4 接種量對乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.4 Effects of inoculum size on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.2.4 發酵時間對丟糟水解液發酵乳酸的影響 由圖5可知,發酵開始96h內,總糖利用率和乳酸濃度逐漸增加,分別提高了75.86%和52.36%;總糖濃度下降明顯,說明乳酸主要在總糖不斷消耗的過程中產生。隨著時間的推移,一方面營養物質消耗殆盡,菌體早衰,發酵后勁不足;另一方面,大的菌球顆粒或聚集也會引起傳氧傳質阻力急劇增加,從而影響乳酸產量和總糖利用率。故確定發酵時間為96h。

圖5 發酵時間對乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.5 Effects of fermentation time on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.2.5 CaCO3添加量對丟糟水解液發酵乳酸的影響 乳酸發酵過程中,發酵產生的乳酸會使反應體系pH快速下降,較低的pH會對菌體正常生長和產酸過程產生強烈抑制,需加入一定的中和劑來控制pH。CaCO3是最為常用的中和劑,作用溫和,不會對細胞造成損傷,有利于菌體生長。同時,溶解釋放的Ca2+在菌體生長和菌球形成過程起重要作用,適量Ca2+有利于米根霉菌絲體的生長及菌球的形成。由圖6可知,未添加CaCO3時,生成的乳酸濃度僅為2.12g/L,總糖利用率為20.83%,可能受到低pH和乳酸反饋抑制的影響。當CaCO3添加量為40g/L時,乳酸濃度迅速上升至5.82g/L,總糖利用率也提高至60.47%。當CaCO3添加量由40g/L提高到70g/L時,乳酸濃度繼續保持高增長,達到10.62g/L,且增幅高于總糖利用率,說明該范圍更有利于乳酸濃度的積累,同時觀察到該階段的米根霉形態為大小均一的小球體,這種形態有利于促進乳酸生成量的提高[1],而且Ca2+對乳酸脫氫酶(LDH)有激活作用,可從一定程度上加快乳酸的生成[18],說明CaCO3的適當增加能提高菌體對糖的利用效率和乳酸積累。隨著CaCO3添加量的繼續增加(80g/L),乳酸濃度反而下降,總糖利用率僅微幅增長,基本保持恒定。因為CaCO3的過量添加會對菌體造成包埋,不利于菌體與培養基接觸而影響發酵進程,影響溶氧傳遞系數,甚至造成局部厭氧環境,導致乙醇等副產物的生成[17]。因此,適量添加CaCO3會促進菌體繁殖生長和乳酸生成。綜合考慮pH調節效果、乳酸產量和菌體形態等因素,確定CaCO3添加量為70g/L。

表2 正交實驗設計與結果Table 2 L9(34) Orthogonal design and experimental results

圖6 CaCO3添加量對乳酸濃度和總糖利用率的影響Fig.6 Effects of calcium carbonate addition on lactic acid concentration and total sugars utilization

2.3 正交實驗優化

在上述單因素實驗結果基礎上,選取一定區間內對米根霉發酵產乳酸效果影響較顯著的CaCO3添加量、pH、接種量和發酵時間4個因素作為研究對象,選取乳酸濃度和總糖利用率2個評價指標進行分析,結果見表2～表4。

從表2可以看出,各因素對乳酸濃度的影響大小順序為D>C>A>B,最優組合為 A2B3C3D2;各因素對總糖利用率的影響大小順序為C>A>D>B,最優組合為A2B3C3D2,不同指標條件下的最優組合一致。從表3和表4方差分析可知,上述四個因素對乳酸濃度和總糖利用率的影響均不顯著。

為了更準確判定最優發酵參數,選取表2中正交最優組合A2B3C3D2條件進行五次重復實驗(取平均值),發現該條件下的乳酸濃度和總糖利用率分別為12.47g/L和76.92%,略低于表2中的直觀優組合7(A3B1C3D2)。鑒此,再次選擇這兩個組合(A3B1C3D2和A2B3C3D2)進行五次重復驗證實驗(取平均值)。結果發現,組合A2B3C3D2條件對應的乳酸濃度和總糖利用率較高,分別為13.27g/L和79.61%,高于組合A2B3C3D2條件對應的12.81g/L和77.58%,但二者差異不顯著(p<0.05)。

綜合上述優化實驗結果,從發酵參數控制、提高乳酸濃度和總糖利用率等角度考慮,確定最優發酵條件為A2B3C3D2,即CaCO3添加量80g/L、pH6.5、接種量3.0%和發酵時間96h。

表3 乳酸濃度的影響方差分析Table 3 Variance analyses statistical data on the factors of lactic acid concentration

注:p<0.05表示差異性顯著(下同)。

表4 總糖利用率的影響方差分析Table 4 Variance analyses statistical data on the factors of the reducing sugars utilization rate

3 結論

米根霉誘變菌株R.oryzaeLS-1的糖代謝研究表明,米根霉R.oryzaeLS-1能分別代謝利用葡萄糖和木糖生產乳酸,且二者共存時對發酵過程具有協同促進作用,能顯著提高乳酸生成濃度和糖酸轉化率,這就為利用木質纖維素中的木糖和葡萄糖發酵生產乳酸提供了理論依據。利用LS-1米根霉發酵丟糟水解液實驗表明,發酵過程中選取氯化銨作為氮源最為適宜,在接種量為3.0%、pH為6.5、發酵時間為96h、CaCO3添加量為80g/L的條件下,乳酸發酵效果最好,濃度達到13.27g/L,糖利用率為79.61%。表明米根霉R.oryzaeLS-1具備發酵丟糟水解液制備乳酸的潛力,這也為丟糟生物質的轉化利用奠定了理論基礎。

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[17]Dong-Mei Bai,Min-Ze Jia,Xue-Ming Zhao,etal. L(+)-

Production of lactic acid from distillers grains hydrolysates byRhizopusoryzaeLS-1

TIAN Yan-hua1,REN Hai-wei2,*,LIU Na-li1

(1.Food Engineering Department of Shanxi pharmaceutical Vocational College,Taiyuan 030031,China;2.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China)

Distillers grains,one of the lignocellulosic biomasses riched in cellulose and hemicellulose,was used as an economically attractive carbohydrate feedstock for production of lactic acid by saccharification and microbial fermentation processes. The aim of this study was to investigate the possibility of lactic acid production from distillers grains hydrolysates by the mutant strainRhizopusoryzaeLS-1 and to optimize the biological conversion of reducing sugars into lactic acid to evaluate the culture conditions. The effects of factors such as inoculations size,CaCO3addition,pH value and fermentation time on the lactic acid concentration and the reducing sugars utilization rate were researched by the method of orthogonal experimental design. In addition,the sugar metabolism ofR.oryzaeLS-1 was also studied. The results show thatR.oryzaeLS-1 has the capability to utilize xylose or glucose as carbon resource,furthermore there are synergic and complementary actions during the coexistence of both sugars. The cooperated operations of metabolism was beneficial to the bioconversion of lignocellulosic biomass for lactic acid production. Fermentation results show that ammonium chloride is the most favorable nitrogen source for lactic acid production,the optimal fermentation conditions are inoculation size of 3.0% seed culture,CaCO3addition of 80g·L-1,fermentation time of 96h and culture pH of 6.5. Under optimal conditions,13.27g/L lactic acid was produced and the sugar conversion rate reached 79.61%. This study provided an encouraging means of producing lactic acid from lignocellulosic resource such as the low-cost distillers grains. It was concluded that the fermentation technics for the production of lactic acid from distiller grains was worthy to be developed on a large scale.

Rhizopusoryzae;distiller grains hydrolysates;lactic acid fermentation

2014-03-04

田艷花(1981-)，女，碩士，講師，研究方向：食品生物技術。

*通訊作者:任海偉(1983-)，男，碩士，講師，研究方向：農副產物資源轉化利用。

國家自然科學基金項目(51366009)；甘肅省杰出青年科學基金項目(1210RJDA016)；蘭州理工大學“紅柳青年教師培養計劃”項目(Q201207)。

TS209

A

1002-0306(2015)01-0192-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.031