ARTP誘變選育高溫蛋白酶高產菌株及其酶學性質研究

薛 剛,陳利娟,吳 斌,何冰芳

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

ARTP誘變選育高溫蛋白酶高產菌株及其酶學性質研究

薛 剛,陳利娟,吳 斌,何冰芳*

(南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816)

以高溫環境土樣中篩選的產高溫蛋白酶菌為出發菌株,利用常壓室溫等離子體誘變技術選育出一株高產突變株BacilluslicheniformisTP1-5,產酶活力達到33200U/mL,為出發菌株的1.56倍。通過乙醇沉淀和陰離子交換層析兩步純化,獲得電泳純的高溫蛋白酶。酶學性質研究表明,該蛋白酶為高溫堿性絲氨酸蛋白酶,酶的最適pH為10.0,最適反應溫度為60℃,具有較好的pH穩定性和熱穩定性;對離子型和非離子型表面活性劑均具有很高的耐受性,為進一步開發應用奠定了基礎。

高溫蛋白酶,誘變選育,純化,酶學性質

蛋白酶是一類存在于動物、植物及微生物中的蛋白質水解酶類,廣泛地應用于食品、醫藥、洗滌劑、紡織及皮革處理等行業[1]。普通蛋白酶往往熱穩定性差,催化溫度低,因此其在實際應用上受到較大的限制。而高溫蛋白酶是一類最適催化溫度為60～80℃的蛋白酶,對高溫、酸堿、有機溶劑、蛋白變性劑具有良好的抗性,可作為高效工業生物催化劑,拓寬蛋白酶制劑的應用范圍[2]。

分離自如溫泉、火山、堆肥等高溫環境的極端微生物是高溫蛋白酶的重要來源[3-4]。通常從自然界所篩選菌種的產酶能力難以達到實際生產所需要的水平,因此人們采用對野生菌種進行誘變選育,以及目標酶類的高效異源表達等手段來進一步提高其產酶能力。常壓室溫等離子體誘變是一種新型的育種技術,該技術可以快速高效地突變各類微生物,已成為獲取高產菌株的有效方法[5]。

本研究通過對自行篩選的產高溫蛋白酶菌株BacilluslicheniformisTP1進行常溫室壓等離子體誘變選育,獲得了一株遺傳性狀穩定的高產菌株,并對其所產高溫蛋白酶進行純化和酶學性質的研究,為進一步的研究與開發高溫蛋白酶奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

地衣芽孢桿菌(BacilluslicheniformisTP1) 由本實驗室分離篩選獲得;酵母粉、蛋白胨 英國Oxoid公司;酪蛋白 Sigma Aldrich公司;其他試劑 均為化學純,采購自國藥集團化學試劑有限公司。

APTP生物育種機 北京思清源生物技術公司;AKTA prime plus蛋白純化系統 美國GE公司;紫外分光光度計UV-2102C 尤尼柯儀器有限公司;冷凍離心機CR21G 日立工機有限公司。

1.2 培養基配方

LB培養基(g/L):蛋白胨10,酵母粉5,NaCl 10(固體LB培養基則再加20g/L的瓊脂粉)。

蛋白酶篩選培養基(g/L):葡萄糖10,酵母粉5,NaCl 5,營養瓊脂20,10%(v/v)脫脂奶粉溶液(10g/L,單獨滅菌,108℃,30min)。

產酶發酵培養基(g/L):葡萄糖40,豆粕粉30,Na2HPO44,MgSO40.2,CaCl20.2,pH自然。

1.3 蛋白酶活力測定

采用紫外分光光度法,參照文獻[6],略有改動。緩沖液是50mmol/L,pH10.0的Gly-NaOH緩沖液,反應溫度為60℃。蛋白酶活力單位的定義:在相應條件下,每分鐘水解酪蛋白產生1μg酪氨酸所需要的酶量。

1.4 ARTP誘變方法

按照ARTP生物誘變育種機的操作流程,以氦氣作為工作氣體,設定功率為100W,通氣量為10L/min,等離子體發射源與樣品之間距離為2mm[5]。為了尋找最佳誘變條件,設定不同的處理時間(20,40,60,80s),然后將處理后的樣品稀釋涂布至LB平板,通過平板菌落計數以未處理樣品為對照計算致死率。

1.5 突變菌株選育

初篩:將最適處理時間處理后的樣品稀釋后涂布至含脫脂牛奶的篩選平板,37℃培養48h后測定水解圈直徑與菌落直徑之比(HC比值),根據HC比值的大小初步衡量該菌株產酶能力的高低。

復篩:接具有較高HC比值突變株至LB液體培養基中,于37℃、180r/min培養過夜得到種子液,按2%接種量接入至發酵培養基中,在相同條件下振蕩培養60h,發酵液離心(10000r/min,10min)后取上清測定蛋白酶活力。

1.6 高溫蛋白酶的分離純化

1.6.1 乙醇沉淀 取20mL粗酶液上清,分別按30%、40%、50%、60%、70%及80%的乙醇濃度依次加入預冷的乙醇進行分級沉淀,每級沉淀結束后4℃靜置2h,離心(12000r/min×15min,4℃)取上清進行下一級沉淀。沉淀蛋白分別用等量的pH10.0、50mmol/L的Gly-NaOH緩沖液溶解并測定酶活力。

1.6.2 DEAE-Sepharose FF陰離子交換層析 將上述乙醇沉淀純化所得酶液進行DEAE弱陰離子層析,平衡緩沖為50mmol/L、pH9.5的Gly-NaOH緩沖液,洗脫緩沖是平衡緩沖液中加入1mol/L的NaCl,流速設定為1mL/min,上樣后收集穿透峰及洗脫峰,檢測各收集峰的酶活力及蛋白濃度。

1.6.3 SDS-PAGE電泳分析 采用濃度為12.5%的十二烷基磺酸鈉(SDS)—聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)垂直板電泳[7]。

1.6.4 蛋白含量測定 采用Brandford法[8],標準蛋白為牛血清白蛋白(BSA)。

1.7 蛋白酶性質的研究

1.7.1 蛋白酶的最適反應pH及pH穩定性 配制pH6.0～12.0的緩沖液,并用各種緩沖配制相應pH的酪蛋白底物溶液,純化后的蛋白酶在pH6.0～12.0條件下進行酶活力測定以確定最適pH。將適當稀釋的酶液分別與不同pH緩沖混合,40℃保溫60min后,取樣測殘余酶活力,由此確定蛋白酶的pH穩定性。

1.7.2 蛋白酶的最適反應溫度及熱穩定性 為考察純化后的蛋白酶的最適反應溫度,在最適pH條件下,于不同溫度(30～70℃)測定純酶的酶活力。在熱穩定性實驗中,純化的酶液經不同溫度處理60min后,在標準條件下檢測蛋白酶活力。

1.7.3 抑制劑和表面活性劑對蛋白酶活力的影響 純化后的酶液與不同濃度的各種抑制劑或表面活性劑混合,30℃下放置30min后檢測蛋白酶殘余酶活力,以不加抑制劑的為對照。

2 結果與分析

2.1 等離子體處理時間對BacilluslicheniformisTP1的致死率

誘變處理劑量或時間不僅影響致死率,同時能顯著影響突變效率,在一個合適的突變效率區間進行有效的篩選是菌種選育的關鍵之處。本研究首先對出發菌株TP1進行不同時間的等離子體射流處理,其致死率曲線見圖1。常溫室壓等離子體對TP1菌株的損傷作用效果明顯,隨著等離子體射流處理時間的增加,其致死率逐漸增大。處理40s殺死約60%的菌體;處理時間達到80s以上時,菌株致死率接近100%。據文獻報道,當致死率在90%左右時,誘變處理對細胞的誘變效應較強[9-10],所以本研究采用60s處理時間(致死率約為92%)對菌株BacilluslicheniformisTP1進行誘變。

圖1 等離子體處理Bacillus licheniformis TP1的致死率曲線Fig.1 The lethal rate of Bacillus licheniformis TP1 treated by ARTP

2.2 ARTP誘變選育蛋白酶高產突變株

出發菌株TP1經ARTP誘變處理,通過初篩和復篩選育出7株產酶活力相對較高的菌株(表1)。由表1可以看出,水解圈與菌落直徑比(HC值)與復篩所測酶活力大小呈正相關,所以初篩使用的水解圈指示標記能夠排除大量的負突變菌株,大大提高了篩選的效率。其中TP1-5菌株的酶活力最高且遺傳性狀穩定(傳代20次產酶能力無下降),通過初步發酵優化其酶活力達到33200U/mL,是出發菌株酶活力的1.56倍。目前國內已報道的產高溫蛋白酶菌株產酶能力大都比較低,例如彭素萍等[11]篩選到的耐熱菌BY25產高溫蛋白酶活力為4170U/mL;唐兵等[12]報道的嗜熱脂肪芽孢桿菌WF146高溫蛋白酶產量為600U/mL;黃光榮等[13]分離到的嗜熱芽孢桿菌HS08產高溫蛋白酶活力為6754U/mL。本研究通過誘變選育獲得的高溫蛋白酶高產菌株,具有產酶活力高且遺傳性狀穩定的特點,為實現高溫蛋白酶的產業化生產奠定了基礎。

表2 蛋白酶TP1純化結果Table 2 Purification of the protease from Bacillus licheniformis TP1-5

表1 菌株TP1誘變選育的篩選結果Table 1 The screening result of mutant strains TP-1

2.3 蛋白酶的分離純化

由于有機溶劑沉淀法方便快捷的特點,本研究采用乙醇沉淀法對高溫蛋白酶進行初步純化。當乙醇濃度達到60%時,目的蛋白開始大量沉淀,當乙醇濃度為70%時,目的蛋白基本沉淀完全,故選取50%～70%沉淀部分回收,并用pH10.0的Gly-NaOH緩沖溶解用于下一步的純化。通過乙醇沉淀,目的蛋白酶得到初步純化及濃縮,酶活回收率為71%,純化倍數為1.9倍(表2)。

將乙醇沉淀回收的酶液上樣至pH9.5 Gly-NaOH緩沖平衡好的陰離子交換層析柱,收集穿透峰及洗脫峰。酶活力測定表明,目的蛋白在pH9.5的條件下不能吸附到柱上,而雜蛋白絕大部分被吸附,從而通過收集穿透峰獲得了電泳純的目的蛋白(圖2)。由此推斷該蛋白酶的等電點較高,在pH9.5條件下仍不能帶有足夠的負電荷吸附至填料。本研究通過兩步純化獲得了電泳純的蛋白酶,該酶的表觀分子量約為30ku,最終酶活回收率為53%,純化倍數為3.1倍(表2)。

圖2 SDS-PAGE分析蛋白純化結果Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified protease注:Line 1:標準蛋白;Line 2:粗酶液; Line 3:乙醇沉淀產物;Line 4:柱層析穿透峰。

2.4 蛋白酶TP1的酶學性質

2.4.1 蛋白酶TP1的最適反應pH以及pH穩定性 催化體系pH對蛋白酶活力的影響見圖3(a),該酶在pH8.0～11.0范圍內具有較高的水解活力,最適pH10.0～11.0,pH7時僅為最適pH時活力的一半,表明該酶為典型的堿性蛋白酶。蛋白酶TP1的pH穩定性測定結果如圖3(b),該酶在pH8.0～10.0范圍內未觀察到酶活損失,顯示了很高的穩定性。當pH達到11時,酶活力損失較大,表明該酶的最適催化pH并非其穩定pH,所以該酶應保存在pH8.0～10.0的體系中,并宜在pH10.0以下實現其高效催化。

圖3 蛋白酶TP1的最適反應pH(a)及pH穩定性(b)Fig.3 The optimum pH and the pH stability of protease TP1

2.4.2 蛋白酶TP1的最適反應溫度以及熱穩定性 催化反應溫度對蛋白酶TP1的酶活力影響見圖4。圖4(a)表明,蛋白酶TP1在50～60℃范圍內具有較高活力,該酶的最適反應溫度為60℃,屬于高溫蛋白酶的范疇。該酶的穩定性如圖4(b)所示,蛋白酶TP1在30～50℃保溫1h后,酶活殘留95%以上,在最適溫度60℃條件下剩余酶活70%左右,但當保溫溫度達到70℃時,蛋白酶TP1變性失活較快,基本檢測不到剩余酶活,這表明該酶在40～60℃范圍內具有較高的熱穩定性。

目前已報道的高溫蛋白酶主要來源于芽孢桿菌,如BacillusstearothermophilusWF146[12],BacilluslicheniformisMIR29[5],BacillussubtilisPE-11[14]等,這些蛋白酶最適溫度通常都在60～80℃,并且在高溫條件下具有較強的穩定性,在高溫洗滌、制革工業、食品高溫處理等行業領域具有廣闊的應用前景[13]。

圖4 蛋白酶TP1的最適反應溫度(a)及熱穩定性(b)Fig.4 Effects of temperatures on the activity and thermal stability of protease TP1

2.4.3 抑制劑和表面活性劑對蛋白酶活力的影響 本研究進一步考察了蛋白酶抑制劑苯、表面活性劑、變性劑等對蛋白酶的影響,結果如表3所示。EDTA對蛋白酶TP-1-5無抑制作用,表明該蛋白酶不屬于金屬酶,常見金屬離子(Ca2+、Mg2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+)對該酶活力影響較小(數據未列出)。該蛋白酶被典型的絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF強烈抑制,由此可判斷該酶屬于絲氨酸蛋白酶。其他的蛋白抑制劑(β-巰基乙醇)和變性劑(Urea)對蛋白酶

表3 抑制劑和表面活性劑對蛋白酶活性的影響Table 3 Effect of inhibitors and surfactants on protease activity

TP1均無顯著影響,說明該酶具有較強的穩定性。此外離子型表面活性劑(CTAB、SDS)與非離子型表面活性劑(TritonX-100、Tween-80)對蛋白酶TP1均無抑制作用,甚至有一定的激活作用,這一性質與已報道的BacilluslicheniformisXG12[15]所產的表面活性劑穩定性堿性蛋白酶相似。高溫蛋白酶TP1對多種變性劑和表面活性劑有比較強的耐受性,可望應用于高溫洗滌等用途。

3 結論

本研究通過對自行篩選的高溫蛋白酶產生菌進行常壓室溫等離子體誘變,獲得高產突變株TP1-5,其酶活達到33200U/mL,相比原始菌株提高了56%,其酶活產量顯著高于國內已報道的產高溫蛋白酶菌株。

通過乙醇沉淀和DEAE柱層析純化,獲得了電泳純的高溫蛋白酶,酶學性質研究表明,該酶屬于堿性絲氨酸蛋白酶,最適pH為10.0,最適反應溫度為60℃,同時該酶對抑制劑和表面活性劑有較強的抗性。以上優良特性,預示高溫蛋白酶在高溫洗滌、制革工業及飼料行業的角蛋白水解等領域具有廣闊的應用前景。

[1]Rao M B,Tanksale A M,Ghatge M S,etal. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,1998,62(3):597-635.

[2]王國惠. 常溫環境中產嗜熱蛋白酶菌資源[J]. 生態學雜志,2007,26(1):21-24.

[3]張燕新,趙印,許敬亮,等. 3 株高溫蛋白酶產生菌的分離與鑒定[J]. 應用與環境生物學報,2007,13(4):561-564.

[4]Ferrero M A,Castro G R,Abate C M,etal. Thermostable alkaline proteases ofBacilluslicheniformisMIR 29:isolation,production and characterization[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,1996,45(3):327-332.

[5]柏中中,孫家鐸,吳斌. 基于常壓室溫等離子體技術誘變選育D-乳酸高發酵速率菌株[J]. 食品工業科技,2013,34(24):173-176.

[6]Shimogaki H,Takeuchi K,Nishino T,etal. Purification and properties of a novel surface-active agent-and alkaline-resistant protease fromBacillussp. Y[J]. Agricultural and biological chemistry,1991,55(9):2251-2258.

[7]汪家政,范明. 蛋白質技術手冊[M]. 北京:科學出版社,1999,42-47.

[8]Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J]. Analytical biochemistry,1976,72(1):248-254.

[9]Hua X,Wang J,Wu Z,etal. A salt tolerant Enterobacter cloacae mutant for bioaugmentation of petroleum-and salt-contaminated soil[J]. Biochemical Engineering Journal,2010,49(2):201-206.

[10]Laroussi M. Low temperature plasma-based sterilization:overview and state-of-the-art[J]. Plasma Proc Polym,2005,2:391-400.

[11]彭素萍,林先貴,王一明. 一株產高溫蛋白酶耐熱菌BY25的產酶條件與酶學性質研究[J]. 土壤,2010,42(3):410-414.

[12]唐兵,周林峰,陳向東,等. 嗜熱脂肪芽孢桿菌高溫蛋白酶的產生條件及酶學性質[J]. 微生物學報,2000,40(2):187-192.

[13]黃光榮,應鐵進,戴德慧,等. 嗜熱芽孢桿菌蛋白酶HS08的分離純化研究[J]. 食品科學,2007,28(4):179-182.

[14]Adinarayana K,Ellaiah P,Prasad D S. Purification and partial characterization of thermostable serine alkaline protease from a newly isolatedBacillussubtilis PE-11[J]. Aaps Pharmscitech,2003,4(4):440-448.

[15]高兆建,李超,候進慧. 表面活性劑穩定性堿性蛋白酶純化及性質研究[J]. 食品科學,2011,32(5):211-216.

Selection of high-yield thermostable protease producing strain by ARTP and the study on its enzymological properties

XUE Gang,CHEN Li-juan,WU Bin,HE Bing-fang*

(College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing University of Technology,Nanjing 211816,China)

In order to obtain an industrial strain with higher thermostable protease production,the original strain ofBacilluslicheniformisTP1 was mutated by atmospheric and room temperature plasmas. A good genetic stability strain TP1-5 was screened from the mutants,which produced 33200U/mL from initial 21300U/mL of the thermostable protease. The protease was purified by ethanol precipitation and anion exchange chromatography to electrophoretic homogeneity. The purified protease had a good pH stability and thermal stability,with optimal temperature and pH was 60℃ and 10.0. The protease also exhibited high stability towards surfactants such as SDS,Tween-80,TritonX-100etal.

thermostable protease;atmospheric and room temperature plasmas(ARTP);purification;enzyme characterization

2014-04-01

薛剛(1988-)，男，碩士研究生，研究方向：微生物學。

*通訊作者:何冰芳(1962-)，女，博士，教授，研究方向：酶工程。

國家863計劃(2012AA022205)；國家973計劃(2011CB710800)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)01-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.028