蛋白質谷氨酰胺酶產生菌的分離篩選和鑒定

張艷芳,賈彩鳳,何 燦,康 立,黃 迪,成 楠,寧顯尚,黃 靜,金明飛,魯 偉,步國建,高紅亮,*

(1.華東師范大學生命科學學院,上海 200241;2. 泰興市東圣食品科技有限公司,江蘇泰興 225411)

蛋白質谷氨酰胺酶產生菌的分離篩選和鑒定

張艷芳1,賈彩鳳1,何 燦1,康 立1,黃 迪1,成 楠1,寧顯尚1,黃 靜1,金明飛1,魯 偉2,步國建2,高紅亮1,*

(1.華東師范大學生命科學學院,上海 200241;2. 泰興市東圣食品科技有限公司,江蘇泰興 225411)

[目的]篩選出能夠產生蛋白質谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)的菌株,并對篩選出的菌株分類和鑒定。[方法]以carboxybenzoxy(Cbz)-Gln-Gly為唯一氮源,從來自全國各地采集到的726份土樣中富集篩選能夠產生蛋白質谷氨酰胺酶的菌株,分別從形態學、生理學和分子生物學方面對所篩選的菌株進行分類鑒定,并測定發酵上清的脫酰胺活性。[結果]共篩選到9株產PG酶的細菌,經鑒定,其中7株為產吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes),一株為解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum),另外一株為粘金黃桿菌(Chryseobacterium.gleum)。[結論]分別發酵測定9株菌的PG酶活性,產吲哚金黃桿菌ZYF120413-7發酵酶活最高,為0.7168U/mL。粘金黃桿菌D4-1-1的產酶能力最低,其酶活為0.1029U/mL。本課題的研究成果擴大了PG酶產生菌株的來源,為后續研究打下了基礎。

蛋白質谷氨酰胺酶產生菌，分離篩選，金黃桿菌屬，鑒定

天然蛋白質含有較多的谷氨酰胺和天冬酰胺殘基,它們會以氫鍵的形式和其他氨基酸交聯,導致蛋白質的溶解性降低,進而影響蛋白的工藝特性,如乳化性、起泡性、凝膠性等[1]。這限制著蛋白質在食品、飲料、保健品、醫藥領域的很多應用。脫酰胺是解決這一問題的重要途徑,研究表明,脫酰胺作用能夠改善蛋白質的溶解性和其他功能特性。蛋白質谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG),是近年來才被研究的一種新型水解酶,它能夠脫去多種蛋白質、多肽或者短肽的氨基[2],將L-β-谷氨酰胺水解成L-谷氨酸和氨,且僅作用于蛋白質或肽的谷氨酰胺基團,而對天冬酰胺殘基或游離谷氨酰胺沒有影響,同時不會導致蛋白質的交聯和水解[3],從而提高蛋白質的溶解度和乳化性等,且該酶在酸性條件下也能起作用,是食品行業中一種非常有前景的酶。2000年Shotaro Yamaguchi 等從解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670T中首次發現了PG酶[4],但由于生產菌株的稀少,目前為止,國內外對PG酶的研究主要集中在該酶的結構[5]和應用[6-8]上,而對能夠產生PG酶的其他菌株研究甚少,這在一定程度上限制了PG酶的大量應用。因此,研究能夠產生PG酶的其他菌種十分必要。

本文詣在篩選能夠產生蛋白質谷氨酰胺酶的菌株,并對其進行分類鑒定,為以后提高菌株的產酶活性和在食品工業中的開發應用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗菌株 9株產蛋白質谷氨酰胺酶的菌株,從采集自全國各地的726份新鮮土樣中分離得到。

培養基:a.篩選培養基(1000mL):carboxybenzoxy(Cbz)-Gln-Gly 1g;Glucose 5g;KH2PO40.2g;MgSO4·7H2O 0.2g;NaCl 0.1g;CaCl20.02g;FeSO4·7H2O 0.002g;NaMO4·2H2O 0.005g;NaWO4·4H2O 0.005g;MnSO4·4H2O 0.005g;CuSO4·5H2O 0.1g;pH 8.0。b. PY培養基(1000mL):polypeptone 10g,Yeast Extract 2g,MgSO4·7H2O 1g。調pH至7.0。c. 發酵培養基(1000mL):lactose 5g;polypeptone 10g;Na2HPO4·H2O 1.7g;KH2PO40.25g;MgSO4·7H2O 0.25g;FeSO4·7H2O 0.05g。調節pH至7.2。d. LB培養基,配方略。

藥品和試劑:酵母粉,胰蛋白胨 購自oxide;聚蛋白胨 購自Nihon Seiyaku;細菌生理生化鑒定管 購自青島高科園海博生物技術有限公司(Qingdao Hope Bio-Technology Co.,Ltd);其他試劑均為國產分析純。

電子天平,酸度計 賽多利斯科學儀器有限公司(北京);全自動高壓蒸汽滅菌鍋 上海博訊實業有限公司;BCN-1360型生物潔凈工作臺 北京東聯哈爾儀器公司;電熱恒溫干燥箱,恒溫水浴鍋,GNP-9160型隔水式恒溫培養箱 上海精宏;恒溫搖床 上海聚辰科學儀器公司;高速冷凍離心機 Thermo;Hitech反滲透超純水機 上海和泰儀器有公司;可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.2 土壤樣品的采集與處理

土樣按照隨機、等量、多點混合的原則進行采集,選擇五點取樣法,用取土鏟鏟去2～5cm的表層土,每個點取樣100g左右,然后將所取的5個點的土樣壓碎,充分混合均勻,依四分法棄去多余部分,揀去枯枝敗葉、石礫等雜質,保留土樣50g左右,存放于4℃的冷藏庫,用于菌株的篩選來源。

1.3 平板法初步篩選產PG酶的菌株

稱取土樣10g加入到含有適量玻璃珠和90mL蒸餾水的錐形瓶中,混勻,制備成土壤懸液。取土壤懸液在超凈臺內靜置10min后的上清液,以2%接種量接種于篩選培養基,220r/min 30℃,培養富集6d。之后取富集后的菌懸液在相同條件下再次富集培養3d。將二次富集后的培養液以10倍梯度稀釋,涂布于LB固體平板,30℃恒溫倒置培養1～2d。用3% KOH溶液噴灑在黃色或橘黃色菌落表面,若菌落變成紅色,則再噴灑3% HCl溶液。若菌落又變回黃色或橘黃色,即為疑似菌株,并進行進一步篩選。挑取疑似菌株接種于LB平板,30℃恒溫倒置培養1～2d。進行簡單染色,觀察菌落形態;并進行革蘭氏染色和芽孢染色,選取革蘭氏陰性,桿狀,不產芽孢的菌株,以Cbz-Gln-Gly為底物,測定其發酵上清中的酶活,進行復篩。

1.4 產PG酶菌株的搖瓶復篩

將篩選到的疑似菌株挑取單菌落接種于試管斜面,30℃恒溫培養1～2d。從試管斜面上刮下菌體,制備菌懸液,接種于PY培養基,30℃ 200r/min恒溫培養12～14h,再以2%接種量接種于發酵培養基,30℃ 200r/min恒溫培養10～15h,4℃,10000r/min離心,棄菌體,上清液中蛋白質谷氨酰胺酶活性的測定方法參考GRAS Notice No. GRN 000267(FDA,2008)并稍作改進。即將上清液稀釋5倍,取0.1mL的上清稀釋液加入到試管中,37℃溫浴1min;然后向其中加入已預熱的0.01mol/L Cbz-Gln-Gly溶液或1.0% 酪蛋白溶液 1mL,37±0.5℃溫浴反應60min。然后加入1mL的三氯乙酸溶液,混合均勻,終止反應。苯酚法測定反應后溶液中氨的含量。A630測定吸光值A1。對照組為先加入三氯乙酸溶液后反應60min后再加入底物溶液。其余操作同實驗組。測定A630為A2。規定每分鐘產生1μmol氨所需的酶的量為一個酶活單位(1U)。發酵液中酶活計算公式如下:

酶活力(U/mL)=(A1-A2)×2.1/0.1×1/17.03×1/60×a×5

A1:實驗組的吸光值;A2:對照組的吸光值;a:苯酚法測定的氨的標準曲線的斜率。

然后選取搖瓶法初篩得到的酶活性較高的菌株進行復篩,重復3次以上。選取酶活性較高且相對穩定的菌株進行形態學、生理學和分子生物學的鑒定。

1.5 菌株形態學鑒定

將篩選到的菌株于LB平板上畫線法分離單菌落,觀察各菌株的單菌落的狀態;并進行革蘭氏染色和芽孢染色[9]。

1.6 菌株的生理生化鑒定

取平板上分離的單菌落,參考說明書通過直接接種法或菌懸液法接種于制備好的生理生化管中,根據需要培養相應的時間,觀察記錄實驗結果。

1.7 16S rDNA序列測定及分析

提取所篩選菌株的總基因組DNA,并以此為模版,擴增該菌株的16S rDNA序列,其引物序列為7f(5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3′),1540r(5′-AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,割膠回收,并送公司測序。測序工作由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。將測得的16S rDNA序列提交到GenBank,并在RDP數據庫中進行序列匹配,從中得到同源性較高的其他菌株的16S rDNA序列。下載并比對分析這些同源性較高的菌株的16S rDNA序列,連同目的序列在ClustalX1.83軟件中進行比對,去除兩端冗余序列,保存為.aln格式,然后在MEGA5.1中構建系統發育樹,對菌種進行分類。構建系統發育樹時選擇neighbor-joining tree,設定Bootstrap replication為1000。

2 結果與分析

2.1 土樣信息的統計和分析

按照土樣的標準采集方法,我們從全國各地共采集到726份土樣,這些樣品覆蓋了中國的25個省、直轄市,其分布情況見圖1(A)。其中華東地區包括上海市、山東省、江蘇省、安徽省、浙江省、福建省,共采集到275份土樣,占全部樣本的38%;西南地區(包括重慶市、四川省、貴州省、云南省、西藏自治區)和華中地區(湖北省、湖南省、河南省,江西省)分別采集到177份和108份,分別占樣本的24%和15%。采樣的地理條件和環境多種多樣,如樹林、草原、農田、山地、公路邊、花園、果園、茶園等,具體分布情況見圖1(B)。充足的樣本量和各種各樣的地理環境為不同微生物的生長和繁殖提供了可能性,為后續篩選產蛋白質谷氨酰胺酶的菌株提供了廣泛而充足的來源。

圖1 土樣的地理分布(A)和采樣環境情況(B)Fig.1 The geographical distribution(A) and the environment(B)of soil samples

2.2 產蛋白質谷氨酰胺酶菌株的篩選和分離

以Cbz-Gln-Gly為唯一氮源,經兩次富集和平板篩選,我們從726份土樣中篩選到168株疑似菌株。這些菌株經純培養后,發酵測定上清液中的PG酶活性,每個菌株3個平行。其結果見圖2(A)。由該圖可知,大部分菌株的酶活性都比較低,沒有利用價值。而酶活在0.6U/mL以上的菌株有24株,選取這些菌株進行搖瓶復篩,每個菌株3個平行,重復篩選3次。第三次搖瓶復篩的產酶情況見圖2(B)。在進行搖瓶復篩時,發現很多菌的產酶能力都有所下降,有些菌株的產酶能力不穩定,而有的菌株退化很快,傳到第三代時菌株的產酶能力幾乎為零,進行分離純化復壯之后,酶活力有所提高。我們從中挑選了7株產酶能力較高且相對穩定的菌株(ZYF120413-7、Y8-12-1、D4-19-1、Y6-17-1、CFL-4-40、HC-12、ZYF120111-1)和2株產酶能力不高但很穩定的菌株(ZYF120810-1和D4-1-1)進行鑒定。

圖2 產PG酶菌株的搖瓶初篩和復篩Fig.2 The screening of strains producing protein-glutaminase with shake-flask cultureA：平板初篩得到的菌株首次進行搖瓶發酵的產酶情況; B：搖瓶法重復發酵三次后的產酶情況。

2.3 細菌的形態和生理生化特征

將9株篩選到的細菌平板劃線法于LB固體培養基上分離單菌落,30℃培養48h,觀察菌株在LB平板上的生長狀況。這9株菌形成的菌落均呈圓形,邊緣整齊,金黃色或橘黃色,不透明,菌落表面濕潤光滑,有光澤。進行革蘭氏染色和芽孢染色發現,菌株均呈桿狀,革蘭氏陰性,不產芽孢。其中Y8-12-1的革蘭氏染色和芽孢染色結果如圖3所示。然后用KOH溶液對菌株產生的色素再次進行鑒定。其中一株菌Y8-12-1的KOH變色反應如圖4所示。由圖可知,該菌株能夠產生典型的黃色色素,且該色素能夠與稀堿溶液KOH起反應,而變成橘紅色或棕黃色。而用HCl溶液中和后,又變回原來的顏色。能夠產生有此性質的不溶性黃色色素是金黃桿菌屬細菌的典型特征之一,此外產黃色素的細菌還有假單孢菌屬和類黃桿菌屬。由此,可初步確定該菌株歸屬于金黃桿菌屬或其相近屬。而其他8株菌都有相同的顏色變化。

表1 所篩選菌株的生理生化實驗結果和比較Table 1 The physiological test results of the isolates and their comparison

圖3 Y8-12-1的革蘭氏染色和芽孢染色觀察Fig.3 The results of Gram’s staining and spore staining of the Y8-12-1A：革蘭氏染色圖;B：芽孢染色圖。

圖4 KOH溶液鑒定菌株產生的色素Fig.4 Change in color of ZYF120413-7 by 3% KOH and 3% HClA：KOH溶液作用前;B：KOH溶液作用后; C：HCl溶液中和后。

注:“+”,陽性;“+-”,弱陽性;“-”,陰性。

對所篩選到的菌株進行常規生理生化鑒定,結果如表1所示。所篩選到的菌株氧化酶、過氧化氫酶均呈陽性,可水解淀粉、明膠、七葉苷等,并能利用麥芽糖、葡萄糖、木糖、海藻糖、阿拉伯糖等產酸。其中D4-1-1和ZYF120810-1的生理生化特征和其他7株有較大差異。將菌株的菌落形態、生理生化特征與《常見細菌系統鑒定手冊》[10]和《伯杰細菌鑒定手冊》[11]中描述進行比對,并查閱相關參考文獻,可初步認定所篩選的菌株歸屬于為金黃桿菌屬。

2.4 系統發育樹的構建和分析

圖5 相鄰交聯法構建所篩選菌株的系統發育樹Fig.5 Neighbour-joining tree of the isolates based on nearly completed 16SrDNA sequences, the scale bar indicates 0. 02 subtitutions per nucleotide position

分別將測序得到的各菌株的16S rDNA堿基全長序列在NCBI GenBank數據庫中用Blast軟件與已有細菌的16S rDNA序列進行相似性比對,發現ZYF120413-7、Y8-12-1、D4-19-1、Y6-17-1、CFL-4-40、HC-12、ZYF120111-1比對出的序列幾乎相同,與之同源性較高的典型菌株為產吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes)LMG 8337(NR_042507.1)。而與D4-1-1同源性較高的菌株為粘金黃桿菌(Chryseobacteriumgleum)CCUG14555(NR_042506.1),與ZYF120810-1同源性較高的菌株為解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670T(AB039830)。然后提交目的序列到RDP數據庫中并搜索和其親緣關系最近的菌株,其數據集選擇可培養的典型菌株,可知所篩選菌株的分類學地位均為:Bacteriadomain,Bacteroidetesphylum,Flavobacteriaclass,Flavobacterialesorder,Flavobacteriaceaefamily,Chryseobacteriumgenus。結果如圖5。從圖中可以看出,菌株ZYF0810-1與Chryseobacteriumproteolyticum的親緣關系最近,且結點處的數值為100,這表明在1000次的bootstrap運算中,兩者聚類到一起的幾率為100%。結合菌落形態、生理生化特征和16S rRNA基因序列分析的結果,可以確定菌株ZYF0810-1是解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum),命名為解朊金黃桿菌ZYF0810-1(ChryseobacteriumproteolyticumZYF0810-1)。同理,D4-1-1命名為黏金黃桿菌D4-1-1(ChryseobacteriumgleumD4-1-1),其余菌株為產吲哚金黃桿菌(Chryseobacteriumindologenes)。

2.5 所篩選菌株的產酶能力比較和分析

將所篩選到的9株細菌反復發酵,測定上清液中的PG酶對底物Cbz-Gln-Gly的活性,其結果如表2所示。Chryseobacteriumindologenes的產酶能力較高,最高為0.7168U/mL,最低為0.6348U/mL,其平均值為0.6759U/mL,是Shotaro Yamaguchi 在2000年篩選出的菌株Chryseobacteriumproteolyticum9670T的產生的酶活性的2.6倍[4]。而另外兩株菌的酶活力較低。

3 結論與討論

通常去酰基蛋白質因為帶負電的基團增多而使等電點降低[12],從而使蛋白質在弱酸性環境下的溶解性增強。一般來說利用酸、堿或機械處理蛋白質可改善蛋白質的溶解性能,但副作用較大,會破壞蛋白質的其他功能[13-14]。所以現在多采用作用條件比較溫和的酶來達到改善蛋白質功能的目的。研究表明,蛋白酶可用于蛋白質的脫酰胺作用,從而改善蛋白質的溶解性和其他功能特性,但是蛋白酶容易引起肽鏈水解,氨基酸消旋等,產生不良的風味[15]。谷氨酰胺轉氨酶(transglutaminase,EC 2.3.2.13)是一種從哺乳類到微生物類分布很廣泛的酶,該酶催化蛋白質中谷氨酰胺殘基的酰基轉移反應,許多有機氨類,包括蛋白質中的賴氨酸殘基,可以作為酰基受體。當反應體系中沒有有機氨時,水可以作為酰基受體,進而導致蛋白質的脫酰胺反應。但是TG酶容易引起蛋白質交聯,從而使蛋白質不溶性增加。但若其過量使用,會對食物造成凝聚等現象。肽谷氨酰胺酶(peptidoglutaminase,EC 3.5.1.43/44)也可用于改善蛋白質的功能性質,只對分子量低于5000的多肽的谷氨酰胺酰殘基起作用,對高分子量的多肽和蛋白不發揮作用,且脫酰胺程度不高[16]。

表2 所篩選菌株的產酶能力比較Table 2 The comparison of protein-glutaminase activity of the isolates

蛋白質谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)的脫酰胺作用較好,具有十分廣泛的工業應用前景。2000年Shotaro Yamaguchi 等從解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum)9670T中首次發現了PG酶[4],隨后公布了該酶的基因序列[17];2010年Kumeta H等揭示了PG酶高級結構和作用機理[5],隨后各研究小組陸續報導了該酶對小麥蛋白[6]、米谷蛋白[7]、大豆蛋白[18]、玉米蛋白[19]、脫脂牛奶[8]等多種蛋白的影響。2012年汪正華[20]通過重疊延伸PCR法合成了PG酶的全長基因,并對其蛋白進行了重組表達。2013年Noriko Miwa研究了PG酶作用后的乳清分離蛋白構象的改變和它的凝膠性能之間的關系[21],Chun Cui研究了PG酶對小麥蛋白的結構影響[22],而Suppavorasatit則對PG酶處理后的豆漿中蛋白的溶解度和豆漿風味的影響進行了探究[23]。

雖然PG酶的脫酰胺作用較好,但目前國內外對PG酶的研究主要集中在該酶的結構和應用上,而對能夠產生PG酶的其他菌株研究甚少,且目前用于工業生產的菌株9670T產酶能力較低,這在一定程度上限制了PG酶的大量應用。因此,研究能夠產生PG酶的其他菌種十分必要。

土壤被認為是地球上微生物多樣性最豐富的環境,據估算,每克土壤中約含數萬個物種,100億左右微生物,而其中有1%的物種可通過分離培養進行研究[24]。中國地域廣闊,地形多樣,自然環境復雜,土壤的物質組成、理化過程等更是豐富多樣,這為微生物的生長和繁殖提供了各種各樣的物理結構與化學營養,因此我國的微生物資源十分豐富。所以我們推測從我國的土壤中應該可以找到PG酶的高產菌株,然后對其進行改造,用于工業生產。

本研究從全國各地采集土樣,以Cbz-Gln-Gly為唯一氮源進行富集和篩選能夠產生PG酶的菌株。我們從中篩選到9株能夠產生PG酶的細菌,并比較了它們形態學、生理學、分子生物學及產酶能力的差異。經鑒定,9株菌均為金黃桿菌屬,這一方面與本文的篩選方法有關,但同時也說明金黃桿菌屬中能夠產生PG酶的菌株較多。9株菌中,其中一株菌Y8-10-1與目前用于工業生產的9670T是同一種,為解朊金黃桿菌(Chryseobacteriumproteolyticum),酶活性也與之相近,為0.2357U/mL。而產吲哚金黃桿菌的PG酶酶活最高為0.7168U/mL,顯著高于9670T。

本課題的研究成果擴大了PG酶產生菌株的來源,并給我們一個提示,PG酶的產生菌株可能廣泛存在于自然界中,我們可以尋找其他的篩選方法,以得到產酶能力更高,性能更加優良的菌株,為工業生產PG酶打下良好的基礎。但是本課題還有很多地方需要深入研究,比如以上菌株產生的PG酶的基因序列,結構酶學性質是否有差異,酶的分離純化條件還有待于研究,菌株的培養條件等還有待于優化。

[1]Fennema O R. 食品化學[Z]. 北京:中國輕工業出版社,2003316-317.

[2]Yamaguchi S,Jeenes D J,Archer D B. Protein-glutaminase fromChryseobacteriumproteolyticum,an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins[J]. European Journal of Biochemistry,2001,268(5):1410-1421.

[3]Marcoa C,Rosell C M. Effect of different protein isolates and transglutaminase on rice flour properties[J]. Journal of Food Engineering,2008,84(1):132-139.

[4]Yamaguchi S,Yokoe M. A Novel Protein-Deamidating Enzyme fromChryseobacteriumproteolyticumsp. nov.,a Newly Isolated Bacterium from Soil[J]. Applied and Environmental Microbiology,2000,66(8):3337-3343.

[5]Kumeta H,Miwa N,Ogura K,etal. The NMR structure of protein-glutaminase fromChryseobacteriumproteolyticum[J]. Journal of biomolecular NMR,2010,46(3):251-255.

[6]Yong Y H,Yamaguchi S,Matsumura Y. Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of wheat gluten[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(16):6034-6040.

[7]Li X H,Zhou X L,Liu Y L,etal. Effects of Glutaminase on the Functional Properties of Rice Glutelin[J]. Food Science,2010,31(17):192-195.

[8]Miwa N,Yokoyama K,Wakabayashi H,etal. Effect of deamidation by protein-glutaminase on physicochemical and functional properties of skim milk[J]. International Dairy Journal,2010,20(6):393-399.

[9]吳坤,張世敏. 微生物學實驗技術[M]. 北京:氣象出版社,2004,20-25.

[10]東秀珠,蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M][G]. 北京:科學出版社,2001:107-113.

[11]Holt J G K N R S. Bergy’s Manual of Deter minative Bacteriology(9th)[G]. London:William &Wilkins Press,1994:259-271.

[12]Hamada J S. Effects of heat and proteolysis on deamidation of food proteins using peptidoglutaminase[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,1992,40(5):719-723.

[13]Shih F F. Deamidation studies on selected food proteins[J]. Journal of the American Oil Chemists’ Society,1990,67(10):675-677.

[14]Schwenke K D. Enzyme and chemical modification of proteins[J]. Food Science and Technology-New York-Marcel Dekkep-,1997:393-424.

[15]Tomotake H,Shimaoka I,Kayashita J,etal. Physicochemical and functional properties of buckwheat protein product[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2002,50(7):2125-2129.

[16]Kikuchi M,Hayashida H,Nakano E,etal. Peptidoglutaminase. Enzymes for selective deamidation of γ-amide of peptide-bound glutamine[J]. Biochemistry,1971,10(7):1222-1229.

[17]Yamaguchi S,Jeenes D J,Archer D B. Protein-glutaminase fromChryseobacteriumproteolyticum,an enzyme that deamidates glutaminyl residues in proteins[J]. European Journal of Biochemistry,2001,268(5):1410-1421.

[18]Li D,Zhao X. Limited Deamidation of Soybean Protein Isolates by Glutaminase and its Impacts on the Selected Properties[J]. International Journal of Food Properties,2012,15(3):638-655.

[19]Yong Y H,Yamaguchi S,Gu Y S,etal. Effects of enzymatic deamidation by protein-glutaminase on structure and functional properties of α-zein[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2004,52(23):7094-7100.

[20]汪正華,朱蓓霖,趙云,等. 蛋白質谷氨酰胺酶基因的合成表達及性質研究[J]. 中國生物工程雜志，2012,32(11):55-60.

[21]Miwa N,Yokoyama K,Nio N,etal. Effect of Enzymatic Deamidation on the Heat-induced Conformational Changes in Whey Protein Isolate and Its Relation to Gel Properties[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(9):2205-2212.

[22]Cui C,Hu Q,Ren J,etal. Effect of the structural features of hydrochloric acid-deamidated wheat gluten on its susceptibility to enzymatic hydrolysis[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2013,61(24):5706-5714.

[23]Suppavorasatit I,Lee S Y,Cadwallader K R. Effect of Enzymatic Protein Deamidation on Protein Solubility and Flavor Binding Properties of Soymilk[J]. Journal of Food Science,2013,78(1):C1-C7.

[24]宋長青,吳金水,陸雅海,等. 中國土壤微生物學研究 10 年回顧[J]. 地球科學進展,2013,28(10):1087-1105.

Isolation and identification of nine bacteria strains producing Protein-glutaminase

ZHANG Yan-fang1,JIA Cai-feng1,HE Can1,KANG Li1,HUANG Di1,CHENG Nan1,NING Xian-shang1，HUANG Jing1,JIN Ming-fei1,LU Wei2,BU Guo-jian2,GAO Hong-liang1,*

(1. College of Life Science,East China Normal University Shanghai 200241,China;2.Taixing Dongsheng Food Science and Technology co.,LTD,Taixing 225411,China)

[Objective]Isolating and screening the strains producing Protein-glutaminase and then making Identification of them.[Methods]726 soil samples from all over the country were collected,from which the strains producing Protein-glutaminase were enriched with Cbz-Gln-Gly as the sole nitrogen source by preliminary screening in plates. Then the isolates were identified in morphology,physiology and molecular biology. The enzyme activity of deamidation was also been detected.[Results]Totally 9 strains that could produce PG were isolated,of which 7 bacteria were identified asChryseobacteriumindologenes,one was identified asChryseobacteriumproteolyticumand another was identified asChryseobacterium.gleum.[Conclusions]The 9 strains were fermented in aerobic,and the PG activity in fermentation supernatant was tested. The results shown thatChryseobacteriumindologenesZYF120413-7 had the highest enzyme activity with 0.7168U/mL.Chryseobacterium.gleumcame the lowest with only 0.1029U/mL. This study enlarged the source of the PG producing strains,lying a good foundation for the following research.

strain of producing protein-glutaminase;screening and isolation;Chryseobacteriumgenus;identification

2014-03-05

張艷芳(1987-),女,碩士研究生,研究方向:食品微生物學及應用。

*通訊作者:高紅亮(1973-),男,博士，副教授,研究方向:微生物谷氨酰胺轉氨酶,蛋白質谷氨酰胺酶,丙酸桿菌細菌素和大豆多糖的工業化生產及應用等。

質檢公益性行業科研專項項目(201310255)。

TS

A

1002-0306(2015)01-0170-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.027