離子交換法分離發酵液中ε-聚L-賴氨酸

劉延嶺,鄧 林

(四川工商職業技術學院,四川都江堰 611830)

離子交換法分離發酵液中ε-聚L-賴氨酸

劉延嶺,鄧 林

(四川工商職業技術學院,四川都江堰 611830)

研究了ε-聚L-賴氨酸發酵液前處理的工藝條件。以蛋白質和ε-聚L-賴氨酸濃度為指標,分別使用5mol/L氫氧化鈉于pH8.5沉淀蛋白質和5ku的聚砜超濾膜進行超濾,達到了良好的去除雜蛋白的效果。同時探討了離子交換法分離發酵液中ε-聚L-賴氨酸的工藝。以ε-聚L-賴氨酸吸附量為指標,采用靜態吸附法選擇合適的樹脂:弱酸型HD-2陽離子交換樹脂,其最大吸附量可達到28.8mg/g。

離子交換法,分離,ε-聚L-賴氨酸

離子交換法是根據發酵產物的酸堿度、極性和分子大小而進行的分離純化技術。在發酵工業中,蛋白質、氨基酸、核酸、酶及抗生素等常用離子交換樹脂法進行分離提純[1]。離子交換法具有成本低、操作方便、提取率高、設備簡單等優點。

ε-聚L-賴氨酸(ε-Poly-L-lysine)是由L-賴氨酸的ε-氨基和另一個賴氨酸的α-羧基之間形成的ε-酰胺鍵連接而形成的一種氨基酸同型化合物[2],可由微生物發酵產生的[3-6]。由于ε-聚L-賴氨酸具有廣譜抗菌性,對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌、霉菌均有很好的抑菌效果,目前已廣泛應用到食品工業的各個領域,如用于面包點心、奶制品、肉制品、冷藏食品和袋裝食品等[7]。

基于ε-聚L-賴氨酸優良的防腐性能及其廣泛的應用前景,近年來其發酵生產和提取工藝成為了國內外研究的熱點。在前期的實驗中,已分離篩選出一株生產菌株[8]。本實驗主要針對發酵液中ε-聚L-賴氨酸的提取進行研究。探索了發酵液預處理的工藝,并考察不同離子交換樹脂對發酵液中ε-聚L-賴氨酸的吸附和解吸性能,確定適用于分離提純ε-聚L-賴氨酸的樹脂類型,以期為ε-聚L-賴氨酸的工業化生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ε-聚L-賴氨酸生產菌株白色鏈霉菌(Streptomyces albus) 四川省食品發酵工業研究設計院篩選保藏;種子培養基 葡萄糖30g/L、酵母膏5g/L、硫酸銨1g/L、磷酸二氫鉀1.2g/L、磷酸氫二鉀1.2g/L、硫酸鎂0.03g/L、硫酸亞鐵0.01g/L、pH6.8;發酵培養基 葡萄糖40g/L、酵母膏8g/L、硫酸銨1.2g/L、磷酸二氫鉀1.5g/L、磷酸氫二鉀1.5g/L、硫酸鎂0.05g/L、pH6.8;ε-聚L-賴氨酸標準品 Sigma公司;考馬斯亮藍G-250 北京西美杰科技有限公司;所用其他試劑均為國產分析純;實驗使用的三種樹脂分別為強酸型陽離子交換樹脂苯乙烯系列734#、弱酸型陽離子交換樹脂丙烯酸系列HD-2和D152,其基本性狀見表1。

表1 3種樹脂的基本性狀Table 1 Basic properties of three types of ion exchange resins

T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;KH30RF高速冷凍離心機 凱達科學儀器有限公司;卷式膜超濾小型實驗機 濟南博納生物技術有限公司;3200P pH測量儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發酵種子液的制備 用接種環挑取一環新鮮培養的孢子,接種到種子培養基中,30℃,180r/min搖床發酵培養36h。

1.2.2 發酵液的制備 將種子培養液按3%接種量接種于發酵培養基中,30℃,180r/min搖床發酵培養72h[9]。

1.2.3 發酵液預處理工藝的選擇 根據劉潔萍[9-12]等人的實驗,從發酵液中分離ε-聚L-賴氨酸時預處理去除雜蛋白有三種方法:濾紙過濾、調節pH和超濾膜過濾。綜合三種方法,本實驗采用先調節pH再超濾的方法對發酵液進行預處理。

將發酵液于5000r/min條件下離心15min,收集上清液,向上清液中加入5%三氯乙酸或5mol/L氫氧化鈉后,調節pH為3、5、6、7、8、9、10。調節上清液pH后,溶液中立即產生大量白色絮狀沉淀。靜置30min,2000r/min進行離心,分別測定離心液中蛋白質濃度和ε-聚L-賴氨酸濃度,以確定發酵液預處理時最佳pH。

1.2.4 發酵液蛋白質含量的測定 按照考馬斯亮藍G-250染色法進行測定。

1.2.5 ε-聚L-賴氨酸含量的測定 使用改進的Itzhaki方法進行測定[13]。

1.2.5.1 標準曲線的制作 取0.2mL ε-聚L-賴氨酸濃度為0～0.12g/L的標準液與0.5mL 500μmol/L甲基橙溶液混合,30℃振蕩反應30min,4000r/min離心15min,將上清液用0.05mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)稀釋10倍,于464nm處測定吸光度,以磷酸鉀緩沖液與甲基橙反應為空白對照。

1.2.5.2 ε-聚L-賴氨酸含量的測定 取發酵上清液2mL與0.5mL 500μmol/L甲基橙溶液混合,30℃下振蕩30min,4000r/min離心15min,將上清液用0.05mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH7.0)稀釋10倍后于464nm處測吸光度。

1.2.6 樹脂靜態吸附及解吸性能測定 稱取按說明書預處理后的三種不同類型的濕樹脂各5g,置于250mL磨口錐形瓶中,加入預處理后的發酵液200mL,25℃振蕩12h后繼續保溫靜置,于不同時段測定吸附后發酵液中ε-聚L-賴氨酸的濃度[14]。按公式(1)計算吸附量。

式(1)

式中:c0為初始濃度(mg/mL);c1為吸附后濃度(mg/mL);V為吸附體積(mL);m為樹脂量(g)。

將上述吸附已飽和的各型樹脂過濾,取一定量加入適量蒸餾水洗滌,再加入200mL 0.1mol/L的鹽酸進行洗脫,25℃振蕩12h后測定洗脫液中ε-聚L-賴氨酸的濃度。按公式(2)計算各樹脂在室溫下的解吸率。

式(2)

式中:c為洗脫液中ε-聚L-賴氨酸濃度(mg/mL);V為洗脫液體積(mL);m為樹脂質量(g);Q為吸附量(mg/g)。

1.2.7 弱酸性HD-2樹脂的靜態吸附曲線 稱取5g弱酸型HD-2樹脂于250mL錐形瓶中,加入200mL經預處理后的發酵液,于25℃恒溫振蕩吸附,每隔1h取樣測定吸附結果,繪制靜態吸附動力學曲線。

1.2.8 HD-2樹脂的最大吸附量測定 稱取5g弱酸型HD-2型樹脂于250mL錐形瓶中,每隔1h加入100mL經預處理后的發酵液,于25℃恒溫振蕩吸附,直至樹脂吸附達到飽和為止。

2 結果與討論

2.1 ε-聚L-賴氨酸標準曲線的繪制

由圖1可知,ε-聚L-賴氨酸濃度在0～0.1g/L范圍內與吸光度存在線性關系。根據標準曲線,可以快速的計算出ε-聚L-賴氨酸的濃度。

圖1 ε-聚L-賴氨酸標準曲線Fig.1 The calibration curve of ε-poly-L-lysine

表2 3種離子交換樹脂對ε-聚L-賴氨酸的靜態吸附與解吸Table 2 The static adsorption capacity and desorption rates of 3 resins of ε-Ploly-L-lysine

2.2 發酵液的預處理

2.2.1 預處理pH的選擇 通過測定可知發酵液pH為4.2。由圖2可知,在pH8和pH9的條件下,所得離心液中蛋白質濃度較小,且ε-聚L-賴氨酸濃度較大。說明在此pH條件下雜蛋白去除效果好,ε-聚L-賴氨酸損失也少。綜合考慮,發酵液預處理中選擇使用5mol/L氫氧化鈉調節發酵液pH8.5,去除雜蛋白。

圖2 不同pH條件下預處理發酵液的結果Fig.2 The results of broth after pretreatment at different pH

2.2.2 超濾法預處理結果 ε-聚L-賴氨酸是L-賴氨酸的聚合物,由25～35個L-賴氨酸殘基通過α-羧基與ε-氨基連接聚合而成。根據文獻資料,其分子量一般為5ku左右[11]。因此,選擇截留分子量為5ku的聚砜超濾膜對去除雜蛋白后的發酵液進行超濾,目的是除去部分大分子蛋白質。使用去除雜蛋白后的發酵液進行超濾,測定超濾后所得透過液和截留液中的蛋白質和ε-聚L-賴氨酸濃度,結果見圖3。

圖3 超濾處理發酵液的結果Fig.3 The results of broth after supernatant treatment

由圖3可知,通過超濾法預處理后,透過液的蛋白質濃度明顯降低,而截留液中蛋白質濃度相對較高,說明大部分大分子蛋白質被截留。同時,ε-聚L-賴氨酸在超濾前后濃度變化不大,說明超濾法具有可行性和有效性。

2.3 三種離子交換樹脂對ε-聚L-賴氨酸的靜態吸附-解吸實驗

所選三種樹脂對ε-聚L-賴氨酸的靜態吸附和解吸結果見表2。

由表2所知,從吸附效果來看,3種樹脂均對ε-聚L-賴氨酸具有一定的吸附能力,其中,弱酸型陽離子交換樹脂HD-2型的吸附效果最好,強酸型陽離子交換樹脂苯乙烯系列734#的吸附效果次之,弱酸型陽離子交換樹脂D152型的吸附效果最差。解吸效果來看,弱酸型陽離子交換樹脂HD-2型的解吸效果最好,能夠較容易地解析下目的產物,而強酸型陽離子交換樹脂苯乙烯系列734#的吸附效果較差,ε-聚L-賴氨酸損失也較多。

綜合以上3種樹脂的吸附和解吸結果,選擇弱酸型的HD-2型樹脂進一步研究。

2.4 弱酸性HD-2樹脂的靜態吸附曲線

由圖4可以看出,HD-2樹脂對發酵液中ε-聚L-賴氨酸的吸附為快速平衡型。在6h之前,吸附量隨著時間的增加而增大,到達6h后,吸附量增加緩慢,達到平衡。

圖4 弱酸性HD-2型樹脂的靜態吸附動力學曲線Fig.4 Static adsorption curve of ε-poly-L-lysine on HD-2 resin

2.5 HD-2樹脂的最大吸附量測定

HD-2樹脂的最大吸附量測定結果見圖5。可以看出,5g弱酸型HD-2樹脂最多可以吸附約800mL發酵液,最大吸附量達到28.8mg/g。

圖5 HD-2樹脂的最大吸附量測定結果Fig.5 The maximum adsorption capacity of ε-poly-L-lysine on HD-2 resin

3 結論

3.1 研究了ε-聚L-賴氨酸發酵液前處理的工藝條件。采用先調節pH再超濾的方法對發酵液進行預處理。分別使用5mol/L氫氧化鈉于pH8.5沉淀蛋白質和5ku的聚砜超濾膜進行超濾,達到了良好的去除雜蛋白的效果。

3.2 研究了離子交換法分離提取發酵液中ε-聚L-賴氨酸的方法。篩選出了弱酸型HD-2陽離子交換樹脂,其最大吸附量可達到28.8mg/g。

[1]牟丹,錢海峰,譚志剛,等.利用超濾技術及離子交換法制取高純度植酸的研究[J].食品工業科技,2014,35(5):225-228.

[2]Yoshimitsu H. Occurrence,biosynthesis,biodegradation,and industrial and medical applications of a naturally occurringε-poly-L-lysine[J]. Biosci Biotechnol Biochem,2011,75(7):1226-1233.

[3]Shima S,Sakai H. Poly-L-lysine Produced By Streptomyces[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1977,41(9):1907-1909.

[4]Shima S,Heiichi S. Poly-L-lysine Produced By Streptomyces

PartⅢ.Chemical Studies[J]. Agricultural and Biological Chemistry,1981,45(11):2503-2508.

[5]黃莉,唐仁勇,張佳敏,等.多聚賴氨酸產生菌的篩選及16SrDNA測序鑒定[J].食品工業科技,2013,34(17):163-167.

[6]黃靜敏,吳清平,劉盛榮,等.ε-聚賴氨酸產生菌新菌株的篩選和產物結構鑒定[J].微生物學通報,2011,38(6):871-877.

[7]揚博,郭麗瓊,鄭冰昕,等.ε-聚賴氨酸產生菌的鑒定及產物特性研究[J].中國食品學報,2011,11(6):163-169.

[8]劉延嶺,周昌豹,李峰,等.ε-聚L-賴氨酸生產菌株的選育[J].四川食品與發酵,2008,4(2):47-49.

[9]劉潔萍.從發酵液中提取生物防腐劑ε-聚賴氨酸的初步研究[D].天津:天津科技大學,2004.

[10]艾婷婷.發酵液中ε-聚賴氨酸提取工藝的初步研究[D].無錫:江南大學,2013.

[11]宗紅,詹耀,吳翔,等.微生物發酵液中ε-聚賴氨酸的分離提純[J].食品科學,2011,32(1):131-134.

[12]張海濤,李燕,歐杰,等.從發酵液中分離ε-聚賴氨酸的樹脂篩選[J].化學研究與應用,2008,20(1):108-112.

[13]Itzhaki R F. Colorimetric Method for Estimating Polylysine and Polyarginine[J]. Analytical Biochemistry,1972,50:569-574.

[14]Toru Takagishi1,Toshihiko Ueno1,Nobuhiko Kuroki1,etal. Interaction of α-poly-L-lysine and ε-poly-L-lysine with methyl orange and its homologs in aqueous solution:Results from dialysis and spectroscopic measurements[J]. Journal of Polymer Science,Polymer Chemistry Edition,1984,22(6):1281-1289.

Study on the seperation of ε-poly-L-lysine from fermentation broth by ion exchange method

LIU Yan-ling,DENG Lin

(Sichuan Technology and Business College,Dujiangyan 611830,China)

The pretreatment ofStreptomycesalbusfermentation broth was studied in order to obtain ε-poly-L-lysine in it. 5mol/L NaOH was added into broth to adjust the pH8.5 in order to precipitate the protein,then 5ku polysulfone membrane was used in ultrafiltration,through which the most impurity protein was removed. The process conditions of ion exchange were also discussed in detail. The weakly acidic cation exchanger resin HD-2 was selected as the best through static adsorption method with the adsorption capacity as index. The maximum adsorption capacity of ε-poly-L-lysine on HD-2 resin was 28.8mg/g.

ion exchange method;separation;ε-poly-L-lysine

2014-04-03

劉延嶺(1973-)，男，本科，高級工程師，研究方向：食品生物技術。

TS202.3

A

1002-0306(2015)01-0073-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.007