微波輔助提取牛蒡多酚和黃酮工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究

蔡茜彤,范金波,馮敘橋,侯 宇

(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013)

微波輔助提取牛蒡多酚和黃酮工藝優(yōu)化及抗氧化活性的研究

蔡茜彤,范金波*,馮敘橋*,侯 宇

(渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院,遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,遼寧錦州 121013)

對牛蒡總酚與黃酮的微波提取工藝和抗氧化活性進(jìn)行了研究。在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,用Box-Behnken設(shè)計(jì),采用3因素3水平的響應(yīng)面分析方法優(yōu)化牛蒡多酚提取工藝。依據(jù)數(shù)據(jù)的模型擬合和回歸分析,確定乙醇濃度和料液比是影響總酚得率的重要因素,乙醇濃度是影響黃酮得率的重要因素,并最終獲得微波輔助提取牛蒡總酚和黃酮的最佳工藝條件為:微波功率140W、乙醇濃度72%、料液比1∶36(g/mL)、提取時間2.5min,在此條件下總酚含量可達(dá)129.68mg/g,黃酮含量可達(dá)23.56mg/g。抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:牛蒡多酚提取物具有一定的金屬離子螯合能力(IC500.288mg/mL)和較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力(IC501.12mg/mL)。

牛蒡,總酚,黃酮,微波,響應(yīng)面,抗氧化活性

牛蒡(ArctiumlappaL.)屬桔梗目,菊科二年生草本植物,牛蒡在溫帶廣泛分布,我國東北、華北、西北地區(qū),華東、華中、西南部分均有種植[1]。牛蒡根含豐富的菊糖及揮發(fā)油、多種多酚物質(zhì)、牛蒡酸、多種醛類,并富含纖維素及各種人體必需的氨基酸[2]。國內(nèi)外對于牛蒡活性成分的研究以菊糖為主,而對于多酚的研究相對較少。

婁在祥[3]利用超聲微波輔助提取牛蒡葉多酚,并鑒定了牛蒡葉的十一種活性成分,包括槲皮素、槲皮苷、咖啡酸、綠原酸、蘆丁、苯甲酸等,且研究發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚提取物有著與合成抗氧化劑TBHQ相近的抗氧化活性。Wang[4]等研究表明牛蒡根甲醇提取物及其主要成分綠原酸和咖啡酸可以抑制低密度脂蛋白氧化。Ku[5]和Liu[6]等報(bào)道牛蒡多酚提取物對于幽門螺桿菌引發(fā)的胃潰瘍有輔助治療作用。Mikami-Konishide等[7]研究日本的71種果蔬多酚提取物清除氧自由基的能力,發(fā)現(xiàn)牛蒡多酚提取物清除氧自由基的能力僅次于長果種、紫蘇和空心菜位于第四位。

隨著人們生活水平的提高,對于食品的要求也越來越高,更傾向于食用富含功能活性成分的食品。天然來源的多酚成分具有多樣的生物學(xué)活性,對人類的健康起著非常重要的作用。本文以牛蒡根為原料,利用微波輔助提取牛蒡多酚,優(yōu)化了提取條件,探討了牛蒡多酚的抗氧化活性,為其進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛蒡 徐州大自然公司；2,2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(DPPH) 百靈威科技有限公司；菲洛嗪(Ferrozine) 合肥博美生物有限公司；Folin-Ciocalteu試劑 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其余試劑 均為分析純。

RRH-A500高速多功能粉碎機(jī) 上海緣沃工貿(mào)有限公司；FD-1-55真空冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UV-2700紫外-可見光分光光度計(jì) 日本SHIMADZU公司；JA5003電子天平 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge5804-R冷凍離心機(jī) 德國eppendorf公司；G70F23CN2P-BM1(SO)微波爐 廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牛蒡預(yù)處理 將新鮮牛蒡清洗切片并于0.5%抗壞血酸溶液中浸泡30min[8],瀝干切碎后,40℃烘干恒重,粉碎,過篩,制得牛蒡干粉。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.2.1 乙醇濃度對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 分別選用0%、20%、40%、60%、80%、100%濃度的乙醇作為溶劑,在提取時間為3min、料液比為1∶20(g/mL)、微波功率140W條件下,研究乙醇濃度對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.2.2 料液比對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 選取料液比1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50、1∶55、1∶60(g/mL),在乙醇濃度70%、提取時間3min、微波功率140W條件下,研究料液比對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.2.3 微波功率對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 選取微波功率分別70、140、210、280、350、420W,在70%乙醇濃度、提取時間為3min、料液比為1∶20條件下,研究微波功率對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.2.4 提取時間對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 選擇提取時間為1、2、3、4、5、6min,在乙醇濃度為70%、料液比為1∶20、微波功率140W條件下,考察不同時間對牛蒡多酚得率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取乙醇濃度、料液比和微波時間為3個考察因素,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法,選三個中心點(diǎn)進(jìn)行15個實(shí)驗(yàn),并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式回歸分析,建立二次響應(yīng)回歸模型,擬合得到二次回歸方程,實(shí)驗(yàn)因素與水平見表1。

1.2.4 總酚與黃酮含量的測定

1.2.4.1 總酚含量的測定 總酚含量的測定采用Folin-Ciocalteu法測定[9]。以沒食子酸為基準(zhǔn)物質(zhì),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到吸光度與總酚質(zhì)量濃度的方程:y=0.00435x+0.0009(R2=0.9989)。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of box-behnken design

取1mL牛蒡提取液加入25mL比色管中,依次加入福林-酚試劑0.2mL,15% Na2CO3溶液2mL,去離子水定容,室溫下靜置60min,于765nm下測定吸光度,測得的吸光度代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得試樣中總酚濃度,并計(jì)算牛蒡總酚含量。

式中:c為比色管中牛蒡總酚濃度(μg/mL)；v1為比色管量程(25mL)；v2為反應(yīng)體系中牛蒡提取液體積(1mL)；v為總酚提取液總體積(mL)；m為牛蒡粉質(zhì)量(g)。

1.2.4.2 黃酮含量的測定 黃酮含量的測定采用NaNO2-Al(NO3)3法測定[10]。以蘆丁為標(biāo)品,制作標(biāo)準(zhǔn)曲線得到吸光度與黃酮質(zhì)量濃度的方程:y=0.0131x-0.0001(R2=0.9987)。取1mL牛蒡提取液加入25mL比色管中,加入5%NaNO2溶液0.4mL搖勻,靜置6min,再加入10%Al(NO3)3溶液0.4mL搖勻,靜置6min,最后加入4%NaOH溶液4.0mL,加去離子水稀釋至刻度,室溫靜置15min,測定509nm處吸光值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,求得試樣中黃酮濃度,并計(jì)算牛蒡黃酮含量。

式中:c為比色管中牛蒡黃酮濃度(μg/mL)；v1為比色管量程(25mL)；v2為反應(yīng)體系中牛蒡提取液體積(1mL)；v為黃酮提取液總體積(mL)；m為牛蒡粉質(zhì)量(g)。

1.2.5 金屬離子螯合能力 將牛蒡提取液真空濃縮,真空冷凍干燥,得牛蒡提取物粉末,用70%乙醇將待測的牛蒡提取物溶解成系列溶液。參照Gulcin等[11]的測定方法,以EDTA為陽性對照,向2.4mL系列濃度的牛蒡提取物溶解液中依次加入現(xiàn)配的30μL2mmol/L的FeCl2溶液和60μL5mmol/L的菲咯嗪溶液,混合均勻后室溫靜置10min,測定混合液在562nm處的吸光值,以等量的超純水代替樣品溶液作為空白對照。以樣品濃度為自變量,自由基清除率為因變量作圖并進(jìn)行線性擬合,計(jì)算IC50值,其中IC50值定義為清除率為50%時所需抗氧化劑的濃度,所需濃度越低,表明該物質(zhì)金屬離子螯合能力越強(qiáng)[12]。

金屬離子螯合率(%)=(1-AS/A0)×100,其中:AS為樣品管的吸光值；A0為對照管的吸光值。

1.2.6DPPH自由基清除活性 稱取9.85mgDPPH以無水乙醇定容至250mL作為DPPH工作液,在反應(yīng)體系中,于10mL試管中加入200μL系列濃度的牛蒡提取物溶解液,再加入2mLDPPH工作液,振蕩搖勻,于室溫下避光靜置30min,測定517nm處的吸光值,以加入等量的乙醇作為空白對照[13]。以樣品濃度為自變量,自由基清除率為因變量作圖并進(jìn)行線性擬合,計(jì)算IC50值。

DPPH自由基清除率(%)=(1-AS/A0)×100,其中:AS為樣品管的吸光值；A0為對照管的吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 乙醇濃度對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 由圖1可知,隨乙醇濃度的增大,總酚和黃酮的得率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢,體積分?jǐn)?shù)為80%時,總酚和黃酮得率均較大,此后隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,總酚和黃酮得率下降,總酚的下降趨勢尤為劇烈。這可能是由于在較低濃度范圍內(nèi),隨著濃度增大,多酚與多糖、蛋白質(zhì)等物質(zhì)之間的氫鍵和疏水作用力越容易斷裂,多酚得率提高[14],但乙醇濃度過大時,由相似相容原理,不易于水溶性多酚的提取,而牛蒡中水溶性多酚含量豐富,使得總酚和黃酮提取率驟降。據(jù)此,乙醇浸提法較適宜的乙醇濃度為80%。

圖1 乙醇濃度對牛蒡總酚和黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.1.2 料液比對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 料液比對多酚和黃酮提取率的影響如圖2所示,總酚和黃酮得率隨著料液比的增大呈現(xiàn)先增加后減小趨勢,總酚得率在料液比1∶45(g/mL)時達(dá)到最大,黃酮得率在料液比1∶40(g/mL)時達(dá)到最大。從成本和精提處理難易分析確定料液比1∶40為宜。

圖2 料液比對牛蒡總酚和黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of liquid ratio on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.1.3 微波功率對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 微波功率對牛蒡多酚和黃酮提取效果的影響如圖3所示。由圖3可知隨著微波功率的增加牛蒡總酚含量呈現(xiàn)先增加后急劇下降的趨勢；由SPSS統(tǒng)計(jì)分析可知微波功率為70W和140W時,黃酮得率沒有顯著差異(p>0.05),微波功率為140W和210W時,黃酮的率有顯著差異(p<0.05),結(jié)合圖3可知,在所選微波范圍內(nèi),黃酮得率呈現(xiàn)先不變后下降趨勢。總酚得率先增加可能是因?yàn)槲⒉üβ始哟髸r,微波加熱速度加快,多酚溶解速度提高,從而加速了多酚由細(xì)胞到溶液中的轉(zhuǎn)移,當(dāng)微波功率增大到一定程度時,總酚和黃酮得率迅速下降,這可能是因?yàn)楦呶⒉üβ十a(chǎn)生的局部高熱破壞了部分多酚成分[15]。綜合考慮總酚和黃酮的得率以及黃酮得率的變化趨勢,確定最佳微波功率為140W，且在響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)中不再考慮該因素。

圖3 微波功率對牛蒡總酚和黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of microwave power on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.1.4 提取時間對牛蒡多酚和黃酮得率的影響 如圖4所示,總酚和黃酮得率呈現(xiàn)先增加后減小趨勢,總酚得率在3min時達(dá)到最大,黃酮得率在4min時達(dá)到最大。這可能是因?yàn)榧?xì)胞破裂、多酚物質(zhì)的溶出需要時間,隨著提取時間的延長,多酚能被充分提取,但時間過長,多酚物質(zhì)可能被微波巨大的機(jī)械能所破壞,從而使得多酚得率下降[16]。綜上,綜合考慮多酚和黃酮的得率,確定最佳提取時間為3min。

圖4 提取時間對牛蒡總酚和黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of polyphenols and flavones in burdock

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化牛蒡多酚和黃酮提取工藝結(jié)果分析

響應(yīng)面分析方案與結(jié)果見表2。利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行線性擬合,獲得微波輔助提取牛蒡總酚含量(Y1)和黃酮含量(Y2)對乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、提取時間(X3)的二次回歸模型方程分別為:

Y1=-1158.63+29.27X1+4.29X2+65.66X3+0.02X1X2-0.17X1X3-0.03X2X3-0.20X12-0.07X22-8.24X32

Y2=-352.45+8.30X1+1.44X2+22.84X3+2.5E-004X1X2-0.07X1X3+9.38E-0.03X2X3-0.05X12-0.018X22-2.80X32

表2 Design-Expert實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 Design-Expert design scheme and experimental results

表3 總酚方差分析Table 3 Analysis of variance(ANOVA)of total polyphenols

表4 黃酮方差分析Table 4 Analysis of variance(ANOVA)of flavones

注:**表示差異極顯著(p<0.01);*表示差異顯著(p<0.05)。

由于因素之間交互作用不顯著,以固定提取時間為0水平的響應(yīng)面分析圖為例,探討因素水平的變化對牛蒡總酚(見圖5)和黃酮(見圖6)含量影響。如圖5所示的響應(yīng)面為開口向下的凸形曲面,有極高值,在一定范圍內(nèi),總酚得率隨乙醇濃度與料液比的增加而增高,乙醇濃度較料液比方向的曲面更陡峭,說明乙醇濃度對總酚含量的影響更為顯著,與方差分析表中結(jié)果一致[17]。分析圖6,乙醇濃度和料液比對牛蒡黃酮得率影響的響應(yīng)面分析圖可得類似結(jié)果。

圖5 Y1=f(X1,X2)的響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface of Y1=f(X1,X2)

圖6 Y2=f(X1,X2)的響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface of Y2=f(X1,X2)

2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

由軟件分析得,最佳提取條件為乙醇濃度72.18%、料液比1∶36.30(g/mL)、提取時間2.66min,在此最優(yōu)條件下總酚含量可達(dá)132.68mg/g,黃酮含量可達(dá)24.63mg/g。結(jié)合實(shí)際操作,確定提取條件為:微波功率140W、乙醇濃度72%、料液比1∶36(g/mL)、微波提取時間2.5min,采取該工藝得到牛蒡總酚含量為129.68mg/g,牛蒡黃酮含量為23.56mg/g。與理論值相比誤差分別為2.26%和4.34%,說明Design-Expert實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)有效的對微波輔助提取牛蒡多酚的條件進(jìn)行了優(yōu)化。

2.4 牛蒡提取物的抗氧化活性

2.4.1 金屬離子螯合能力 將牛蒡提取物粉末用70%乙醇配制成0～1.0mg/mL溶液,不同濃度牛蒡提取物的金屬離子螯合能力如圖7(a)所示,金屬離子螯合率隨牛蒡提取物溶液濃度的增加而增大最后趨于水平,當(dāng)濃度為0～0.4mg/mL時,金屬離子螯合能力近似線性增加,對該區(qū)間線行擬合可得牛蒡提取物螯合金屬離子的IC50值為0.288mg/mL,類似的,由圖7(b),當(dāng)EDTA濃度為0～0.007mg/mL時,金屬離子螯合能力呈線性增加,通過線性擬合得到EDTA螯合金屬離子的IC50值為0.0058mg/mL,說明牛蒡提取物具有一定的金屬離子螯合能力。

圖7 不同濃度牛蒡提取物(a) 和EDTA(b)的金屬離子螯合能力Fig.7 Ferrous ions chelating activity of different concentrations of burdock extraction and EDTA

2.4.2 DPPH自由基清除能力 將牛蒡提取物用70%乙醇配制成不同濃度的溶液,不同濃度牛蒡提取物溶液的DPPH自由基清除能力見圖8。如圖所示,在選定濃度范圍內(nèi),牛蒡提取物對DPPH清除率呈線性關(guān)系增加,R2=0.9969,據(jù)此可以計(jì)算出牛蒡提取物清除DPPH自由基的IC50值為1.12mg/mL,筆者前期研究中得到合成抗氧化劑BHT清除DPPH自由基IC50值為0.36mg/mL[18],可見牛蒡提取物有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力。曹旭等[19]研究牛蒡根黃酮提取物清除DPPH自由基的IC50值為15.7mg/mL,遠(yuǎn)高于本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果,差距較大可能是因?yàn)榕］蛟媳旧淼目寡趸圆町?也可能是因?yàn)槲⒉ㄝo助作用提高了多酚和黃酮的得率。

圖8 不同濃度的牛蒡提取物 對DPPH自由基清除率的線性擬合結(jié)果Fig.8 Dose-dependent inhibition of burdock extraction on DPPH free radicals and its linearity correlation

3 結(jié)論

在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上,使用Design-Expert 8.0.6軟件優(yōu)化微波輔助提取牛蒡多酚的提取工藝,結(jié)合實(shí)際操作確定最佳實(shí)驗(yàn)條件為微波功率140W、乙醇濃度為72%、料液比1∶36(g/mL)、提取時間為2.5min,在此條件下,牛蒡總酚含量達(dá)129.68mg/g,牛蒡黃酮含量達(dá)23.56mg/g。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)研究表明:牛蒡提取物具有一定的金屬離子螯合能力,IC50值為0.288mg/mL,具有較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力,IC50值為1.12mg/mL。

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Optimization of process for microwave-assisted extractionof polyphenols from burdock and its antioxidant activity

CAI Xi-tong,FAN Jin-bo*,FENG Xu-qiao*,HOU Yu

(Food Science Research Institute of Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,Jinzhou 121013,China)

The microwave-assisted extraction process and antioxidant activity of total phenols and flavones from burdock were studied. To optimize the process of polyphenol extraction from burdock,the response surface methodology with three factors at three levels was adopted on basis of single factor experiments. Model fitting and regression analysis of experimental data showed that two significant factors which influenced total phenol yields were ethanol concentration and liquid ratio,and one significant factor which influence flavone yields was ethanol concentration. The results showed that the optimal extraction conditions were the presence of microwave power 140W,72% ethanol solvent,extraction time 2.5 minutes and liquid ratio 1∶36g/mL. Under the optimal conditions,the yield of total phenols and flavones from burdock reached 129.68mg/g and 23.56mg/g respectively. The polyphenol extraction from burdock showed a certain ferric ions chelating ability(IC500.288mg/mL)and strong DPPH radical scavenging activity(IC501.12mg/mL).

burdock;total phenol;flavone;microwave;response surface;antioxidant activity

2014-06-30

蔡茜彤(1989-)，女，在讀研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

*通訊作者:范金波(1977-)，男，博士，講師，主要從事食品生物化學(xué)方向的研究。 馮敘橋(1961-)，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工及貯藏工程。

遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(LNSAKF2013017)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)03-0275-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.03.049